李懿璞，童丽秀，蔺雅楠，苏治军，包海柱，王富贵，刘剑，屈佳伟，胡树平，孙继颖，王志刚，于晓芳，徐明良，高聚林
玉米耐低氮功能研究
李懿璞1,2，童丽秀3，蔺雅楠1,2，苏治军1,2，包海柱1,2，王富贵2,4，刘剑2,4，屈佳伟1,2，胡树平2,4，孙继颖1,2，王志刚1,2，于晓芳1,2，徐明良3，高聚林1,2
1内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010018；
2内蒙古自治区高校寒旱区作物种质资源保护与利用工程研究中心，呼和浩特 010018；
3中国农业大学农学院，北京 100193；
4内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头 014109
【目的】土壤氮素缺乏影响玉米的产量和品质，是中国玉米生产面临的重大问题。编码转录因子，具有一因多效性，ZmCCT10是调控玉米生长发育和响应非生物胁迫重要的调节因子。解析玉米耐低氮的分子机制、聚合抗性基因，为培育耐低氮和氮高效玉米品种奠定基础。【方法】通过比较近等基因系在低氮胁迫和完全营养水培条件下与耐低氮胁迫相关的性状，分析低氮胁迫后的表达模式，选择在近等基因系表达量差异最大的部位与时间点，进行转录组测序。发掘玉米响应耐低氮反应的特征，探究其参与耐低氮反应的分子机制。【结果】在低氮胁迫条件下，近等基因系Y331-ΔTE和Y331的根长性状、生物量、氮素生理指标显著差异。其中，不带有转座子插入的单倍型Y331-ΔTE的总根长、主胚根长、侧根长均显著长于Y331；
根干重、地上部干重、氮积累量、硝酸还原酶活性也显著高于Y331。在低氮胁迫后，在根部和叶片的表达量均显著高于对照处理，且近等基因系间的表达量也具有显著差异，根部和叶片的表达模式也不同。胁迫处理3 h后，在根部的表达量达到峰值，而在叶片的表达量随胁迫处理时间的增加而持续升高，在胁迫处理后6 h达到峰值。选取0.04 mmol·L-1低氮胁迫处理3 h的根部样品进行转录组测序，生物学重复间的相关系数达0.9以上。GO富集分析表明，低氮胁迫后，参与胺化物合成过程和细胞氮化物代谢过程的基因在近等基因系间的表达量差异显著。结合差异基因的表达量和表达模式，筛选调控参与玉米耐低氮反应的候选基因。经qRT-PCR验证，转录组测序获得的与耐低氮相关的、等基因在近等基因系胁迫前后的表达量差异显著。【结论】是一个以转录调控的方式参与玉米耐低氮反应的候选基因。
玉米；
；
耐低氮；
转录因子；
转录组
【研究意义】目前，玉米是中国种植面积最大的粮食作物，在保障国家粮食安全中发挥着重要的作用。而土壤基础肥力低是影响玉米增产的主要因素之一[1]。因此，施用氮肥成为玉米增产的重要措施之一。然而也给生产实践带来了问题：氮肥过量施用，不但会导致氮肥利用率下降，生产成本提高，而且还会带来环境污染等负面问题[2]。因此，国家提出了化肥零增长战略计划，在保障粮食丰产的前提下，减少化肥施用量，提高肥料利用率。不同玉米品种的氮利用效率存在差异，通过遗传学等手段选育氮高效品种是解决粮食生产安全、提高氮效率、降低环境污染的根本途径[3]。【前人研究进展】CCT基因是指编码蛋白包含CCT（CONSTANS、CONSTANS-LIKE和TOC1）结构域的基因的统称。CCT结构域由43—45个氨基酸组成，最早在拟南芥、类基因和（）编码蛋白的C端被发现，结构保守[4]。该基因编码的转录因子属于锌指蛋白超家族[5]，主要参与调控植物光周期反应、昼夜节律反应、光形态建成、产量相关性状和非生物胁迫响应等功能，具有一因多效性[6]。目前已在水稻、玉米、小麦等作物中克隆了CCT基因。最新研究发现的水稻CCT基因——正调控氮素利用。ZmCCT10转录因子参与调控玉米光周期反应、茎腐病抗性、雄穗分支数、节根数、雄性生殖细胞数量等多个生理代谢过程[7-14]。另外，所在区段也是玉米控制氮效率、响应非生物胁迫的热点区段，通过调控地下节根数来促进根系吸收土壤深层的养分[15-16]。氮代谢速率可以反映作物耐低氮的能力，氮代谢速率受硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）等调节，其中，硝酸还原酶是氮代谢过程中最重要的限速酶。此外，氮素还是叶绿素和辅基（NAD、NADP、FAD）的重要组成成分，从而通过这些物质影响作物的光合作用[17]。目前，在水稻中克隆了与高氮利用效率相关的基因，将其导入粳稻品种可大幅度提高粳稻的氮肥利用率[18]。Ma等[19]研究表明，玉米ZmMPK5蛋白通过与ZmABA2互作调节玉米的耐低氮、耐盐胁迫、耐干旱等逆境胁迫反应。此外，Yoon等[20]研究表明，玉米bZIP转录因子家族参与调控玉米对耐低氮、干旱等非生物胁迫的反应。【本研究切入点】目前，玉米耐低氮研究主要集中在相关性状QTL的精细定位和候选基因的筛选，然而对参与玉米耐低氮过程的单一基因效应的评价研究较少。【拟解决的关键问题】本研究利用前期研究创制的近等基因系的耐低氮性状测定，结合转录组分析，阐明参与玉米耐低氮的分子机制，为选育玉米耐低氮品种，提高氮肥利用率提供理论依据。
1.1 试验材料
采用玉米抗茎腐病主效QTL精细定位时构建的近等基因系Y331-ΔTE（上游不带CACTA转座子片段的个体）和Y331自交系。
1.2 低氮胁迫处理近等基因系耐低氮性状调查
2016年在中国农业大学智能人工气候室和2018 —2020年在内蒙古农业大学农学院日光温室中进行。采用完全随机试验设计，设置完全营养液和低氮胁迫2个处理，4次重复；
每个培养钵种植4株玉米苗，每个处理4钵。
首先将充分吸水的玉米种子用10%（v/v）双氧水浸泡30 min；
用无菌去离子水冲洗干净，再用饱和CaSO4溶液浸泡6—8 h；
再次冲洗，转至铺有滤纸的托盘上，28℃黑暗条件下催芽。待种子露白后，挑选长势一致的种子，用滤纸卷好，黑暗培养；
当胚芽整齐地伸长至滤纸上方2 cm时，选择光照16 h/黑暗8 h培养；
直至幼苗长出1—2片可见叶时，挑选长势一致的幼苗，去除胚乳后，移到1/2浓度营养液的培养罐中培养；
第二天换成全营养液（Hoagland培养液），隔一天换一次营养液。待玉米水培苗长至三叶期（培养约15 d），用0.04 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O+3.96 mmol·L-1CaCl2代替4.0 mmol·L-1Ca(NO3)2进行低氮胁迫处理，以完全营养液处理的水培苗为对照。胁迫处理一周后测定地上部干重和根部干重；
每个处理测量16株，求平均值。收获水培苗的根系，并扫描成图片，用WinRHIZO 2004b software、Image J软件测量根的长度，包括总根长（total root length，TRL）、主胚根长（primary radicle length，PRL）、主干根长（main root length，MRL）及侧根长（lateral root length，LTL）。用SPAD-502型便携式叶绿素仪测量植株第三片叶的叶绿素含量；
采用凯氏定氮法测定氮含量；
氮积累量＝植株干重×氮含量。采用离体法测定硝酸还原酶活性，绘制标准曲线进行测定。
硝酸还原酶活性（NO2-1·g-1·h-1）=(C-C0)×Vt/(Wf×t)
式中，C为根据回归曲线计算的NO2-1值；
Vt为稀释倍数；
Wf为样品鲜重（g）；
t为反应时间（h）。
1.3 低氮胁迫条件下ZmCCT10的表达分析
选取低氮胁迫和对照处理0、1.5、3和6 h水培苗根和叶片进行基因表达分析，利用植物总RNA提取试剂盒（DP432）（TANGEN，北京）分别提取玉米根部和叶片总RNA，利用® First-Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen，北京）将其反转录成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（DDR802A）（TaKaRa，大连）进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）表达分析，3个生物学重复，且每个样品设置3个技术重复。以玉米（Gene ID：542367）为内参基因，利用2-△△Ct法分析基因的相对表达情况。
1.4 转录组分析
经0.04 mmol·L-1低氮胁迫处理3 h后，取根部样品进行转录组测序，每个处理3次生物学重复。利用天根RNA prepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441）提取RNA，选用RIN≈5.5；
28s/18s≥1.5；
1.7＜OD260/OD280＜2.0的样品进行转录组测序。采用IlluminaNovaSeq 6000平台进行测序。运用HISAT高效对比系统将测序得到的高质量Clean Data与玉米参考基因组（ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/ release-40/fasta/zea_mays/dna/）进行比对，对12个样本每千个碱基的转录每百万映射读取值（fragments per kilobase per million，FPKM）进行统计。利用DESeq2计算差异比较样本之间的FPKM比值（fold change）和错误发现率adj，以|log2fold change|≥2和adj≤0.05为差异基因筛选标准。
1.5 玉米响应耐低氮胁迫基因的qRT-PCR验证
根据转录组测序分析结果，设计候选基因引物（表1）进行实时荧光定量PCR验证，方法同1.3。
表1 荧光定量PCR引物
2.1 低氮胁迫条件下ZmCCT10近等基因系耐低氮性状的差异性分析
通过对近等基因系Y331-ΔTE和Y331的水培苗进行耐低氮胁迫相关性状调查（图1和图2）。低氮胁迫条件下，Y331-ΔTE的根系生长状态明显好于Y331（图1-a—c），Y331-ΔTE的总根长（TRL）、主胚根长（PRL）、侧根长（LTL）极显著长于Y331（图2-a—d），而对照处理下Y331-ΔTE和Y331的根长差异不显著（图1-a）。低氮胁迫条件下，Y331-ΔTE的生物量（地上部干重和根的干重）均显著高于Y331（图2-e—f）。近等基因系的氮积累量和硝酸还原酶活性均呈下降趋势，但Y331-ΔTE的氮积累量和硝酸还原酶活性均显著高于Y331（图2-h—i）；
二者的SPAD值差异不显著（图2-g）。结果表明，在低氮胁迫条件下，Y331-ΔTE表现出比Y331更强的抗性，推测可能参与调控玉米耐低氮胁迫过程。
a：Y331-ΔTE和Y331植株。Control：对照，LNS：低氮处理；
b：Y331-ΔTE的根系；
c：Y331的根系。1：主胚根；
2：主干根；
总根长减去1和2的部分即为侧根
2.2 在低氮胁迫条件下近等基因系ZmCCT10的表达分析
qRT-PCR试验结果表明，与对照处理相比，在低氮胁迫条件下，近等基因系的叶片和根部的表达模式完全不同（图3）。0.04 mmol·L-1氮胁迫处理条件下，在Y331-ΔTE和Y331植株叶片的表达量不断升高，在处理后6 h达到峰值，且在Y331-ΔTE中的相对表达量约是Y331的4倍（图3-c）。低氮处理3 h后，在Y331-ΔTE根部的表达量达到峰值，然后开始下降，而Y331在低氮处理后表达量变化较小（图3-d）。比较Y331-ΔTE在0.04 mmol·L-1氮胁迫处理后表达量，根部表达量升高的幅度比叶片大（图3-c—d）。综上表明的表达响应低氮胁迫，Y331-ΔTE植株中的表达量变化幅度比Y331更大，表现出更强的抗性。
2.3 在低氮胁迫条件下ZmCCT10近等基因系的转录组分析
转录组测序的每个处理3次生物学重复间的相关系数达0.9以上（图4-a），说明转录组测序的样本设置合理，以确保后续的差异基因分析结果的可靠性。与对照Y331相比，低氮胁迫处理后的Y331_S差异表达基因为7 462个，其中，与氮代谢有关的基因有17个；
与对照Y331TE（上游不带CACTA转座子的单倍型，与Y331-ΔTE相同）相比，低氮胁迫处理后的Y331TE_S差异表达基因为2 156个（图4-b）。其中，与离子转运有关的基因有13个，涉及碳氮水解酶、氮化合物代谢与转运；
与氢离子泵活性有关。经聚类分析，在低氮处理后，玉米细胞丝裂元蛋白激酶5（mitogen protein kinases 5，；
Gene ID：541618）等7个基因在近等基因系间的表达模式不同（图4-c）。经GO功能富集分析，以adj≤0.05作为显著性富集的阈值，比较Y331与Y331_S和Y331TE与Y331TE_S共有的GO路径，按生物过程、细胞组分和分子功能三大类别各筛选5个与耐低氮相关的GO进行分析，其中，胺生物合成过程（GO：0009309 amine biosynthetic processvalue=6.1×10-6，adj=0.00156）与细胞氮化合物代谢过程（GO：0044270 cellular nitrogen compound catabolic processvalue=1.3×10-4，adj=0.04031）差异显著（图4-d），与Y331和Y331TE的GO富集结果比较，筛选出的GO差异不显著，说明这些GO不存在本底差异。
a：总根长；
b：主胚根长；
c：主干根长；
d：侧根长；
e：根干重；
f：地上部干重；
g：SPAD值；
h：氮积累量；
i：硝酸还原酶活性
图3 低氮胁迫条件下ZmCCT10在Y331-ΔTE和Y331叶片（a和c）、根部（b和d）的表达分析
a：RNA-Seq样本间相关性热图；
b：差异基因韦恩图；
c：差异基因聚类分析；
d：GO富集分析柱状图
2.4 低氮胁迫条件下差异表达基因的qRT-PCR验证
从转录组测序数据获取的差异表达基因中，选取聚类分析中对照处理表达模式相同，低氮胁迫处理后表达模式不同的基因进行验证。低氮胁迫处理后，玉米细胞丝裂元蛋白激酶5基因（）在近等基因系中均上调表达，在Y331-ΔTE中的表达量上升幅度较大，是Y331的1.9倍，表现为正调控（图5-a）；
玉米烟酰胺合成酶3基因（nicotianamine synthase 3，；
Gene ID：100285295和玉米b-ZIP转录因子44基因（bZIP transcription factor 44，；
Gene ID：100285656在近等基因系中下调表达，Y331下调幅度较大，分别下调5.2和3.4倍，而Y331-ΔTE下调均不到1倍。表现为负调控（图5-b和图5-d）；
玉米烟酰胺合成酶2基因（nicotianamine synthase 2，；
Gene ID：541637）在近等基因系间的表达模式则完全不同，在Y331中的表达量下调8.5倍，而在Y331-ΔTE中的表达量则上调2.7倍（图5-c）。通过qRT-PCR验证，证实了转录组测序数据的可靠性，进一步表明通过调控与氮代谢相关基因的表达，从而调控玉米的耐低氮能力。
图5 差异表达基因的qRT-PCR的验证
3.1 CCT基因一因多效性与作物产量
CCT基因是一大类基因，编码的蛋白为转录因子，最初研究发现的主要功能是调节作物的光周期反应和开花期。后续研究发现几个重要的CCT基因在不同的粮食作物中均表现出一因多效性，且解释的表型变异占比较高，具有较高潜在的育种应用价值。最新克隆的小麦就属于CCT基因，同时调控小穗数、分蘖数以及单株产量，是小麦增产的一个非常重要的基因[21]。水稻能够调节水稻的抽穗期、分蘖数、单株产量、耐旱性等性状，对水稻增产有显著的促进作用[22-23]。最新研究发现，Ghd7作为一种转录抑制因子，能够直接与氮高效负调控因子基因启动子和第一个内含子上的2个Evening Element-like基序结合，以协同方式抑制其表达，从而正调控氮素利用。和优良等位基因的组合显著提高了低氮条件下水稻的氮素利用率和产量，为水稻氮利用的遗传改良提供了潜在的靶点[24]。是与亲缘关系最近的CCT基因，同属CMF（CCT motif family）亚家族[5-6]。上述这些一因多效的CCT基因均参与调控作物的生长发育、逆境胁迫、产量性状和其他农艺性状。本研究表明参与了玉米响应耐低氮胁迫反应，增强了玉米耐低氮的能力，扩大了调控玉米响应非生物胁迫反应的范围。然而，ZmCCT10蛋白结合的顺式作用元件和序列，以及其通过哪些生理生化反应增强了玉米耐低氮的能力，还需进一步研究。
3.2 耐低氮玉米的鉴定与氮高效玉米的选育
玉米耐低氮是复杂的数量性状，探究玉米耐低氮的分子机制是提高玉米耐低氮能力的重要基础[25]。通常情况下，根据玉米的生长发育特性，可将玉米耐低氮鉴定分为苗期耐低氮鉴定和全生育期耐低氮鉴定。全生育期鉴定是作物耐逆研究的常规方法，它可以利用产量性状对玉米的耐低氮特性进行评价。但是，全生育期鉴定受到诸多因素的限制，实践中，大田条件下土壤含氮量存在较大差异，很难实现唯一差异性原则，在一定程度上影响了耐低氮玉米的鉴选[26-28]。有研究表明，玉米氮素的敏感时期在生育前期，前期对氮素的吸收总量虽不多，却非常重要[29]。如果玉米苗期严重缺乏氮素，将会对产量产生无法弥补的损失[30-31]。本研究利用水培方法，对三叶一心期的玉米进行低氮胁迫，既能准确地控制氮素含量，也可以准确地测量玉米的根部性状，这是目前解析玉米耐低氮分子机制和耐低氮玉米筛选的主要方法。
玉米氮高效主要分为2种类型：一为高氮高效型；
二为低氮高效型。低氮高效型是指在较低的氮素水平环境条件下就能够实现产量目标，也称之为耐瘠型品种[32]。大量研究表明，高氮高效型玉米在低氮条件下并不能表现出氮高效，而低氮高效型在高氮水平下却往往表现出氮高效，这与玉米氮素利用效率和环境因素有关[29]。参与玉米的耐低氮反应，极有可能在高氮条件下也表现为氮高效。耐低氮玉米品种既能节约氮肥，降低肥料对环境的污染，又可以提高土壤肥力低下地区玉米的生产水平。不断深入对玉米耐低氮分子机制的研究，选育并推广低氮高效玉米新品种，将对中国现有的玉米生产方式产生深远的影响。
低氮胁迫显著影响了近等基因系的根长性状和生物量。低氮胁迫下，玉米叶片和根部的表达量均显著提高，在叶片中，6 h达到峰值；
在根部，3 h达到峰值，且在Y331-ΔTE中的相对表达量显著高于Y331。低氮胁迫后参与胺化物合成过程和细胞氮化物代谢过程的基因在近等基因系间表达量差异显著。在低氮胁迫后，对表现为正调控，和表现为负调控，在Y331中的表达量下调8.5倍，而在Y331-ΔTE中的表达量上调2.7倍。表明通过调控与氮代谢相关基因的表达，从而参与了玉米响应耐低氮反应。
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Investigation of Low Nitrogen Tolerance of
LI YiPu1,2, TONG LiXiu3, LIN YaNan1,2, SU Zhijun1,2, BAO HaiZhu1,2, WANG FuGui2,4, LIU Jian2,4, QU JiaWei1,2, HU ShuPing2,4, Sun JiYing1,2, Wang ZhiGang1,2, YU XiaoFang1,2, XU MingLiang3, GAO JuLin1,2
1Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018;2Region Research Center for Conservation and Utilization of Crop Germplasm Resources in Cold and Arid Areas, Hohhot 010018;3College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193;4Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University, Baotou 014109, Inner Mongolia
【Objective】The lack of soil nitrogen impacts the yield and quality of maize, which is a major problem of maize production in China.encodes the transcription factor, which is pleiotropic. ZmCCT10 is a very important co-factor regulating the growth, development and responding to abiotic stress of maize. The molecular mechanism of maize tolerance to low nitrogen is the basis for breeding maize varieties with low nitrogen tolerance and high nitrogen efficiency.【Method】In this study, we compared the traits those relate to low-nitrogen tolerance, expression pattern ofand transcriptome results ofnear-isogenic lines under low-nitrogen stress and complete nutrient conditions. To analysis the characteristics of【Result】 This study indicated that different alleles ofshowed significant differences in root length traits, biomass and nitrogen physiological traits under low nitrogen stress. The Y331-ΔTE haplotype without transposon insertion ofhad significantly longer total root length, main radicle length and lateral root length than Y331 after low nitrogen stress. What is more, root dry weight, shoot dry weight, nitrogen accumulation and nitrate reductase activity were also significantly higher than Y331. The expression levels ofcontinued to increase and peaked 6 hours after stress treatment. Root samples were collected under 0.04 mmol·L-1low nitrogen stress after 3h for transcriptome sequencing. The correlation coefficients between biological replicates are more than 0.9. GO enrichment analysis showed that the expression levels of amine synthesis process and cellular nitrogen compound catabolic process were significantly different in near-isogenic lines after low nitrogen stress. Combined with the amount and expression pattern of differential genes,-regulated candidate genes involved in low-nitrogen tolerance were selected. qRT-PCR confirmed that the expression levels of,and other genes were significantly different after stress in near-isogenic lines. 【Conclusion】is a candidate gene involved in low nitrogen tolerance in maize and it participates in the low-nitrogen tolerance response of maize as transcriptional regulation.
maize;; low nitrogen resistance; transcription factor; transcriptome
10.3864/j.issn.0578-1752.2023.06.002
2022-12-09；
2022-12-27
内蒙古自然科学基金（2020BS03036）、内蒙古自治区直属高校基本科研业务费项目（BR22-11-02）、内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19048）、内蒙古农业大学高层次人才引进科研启动项目（NDYB2018-12）
李懿璞，E-mail：liyipu1987@163.com。童丽秀，E-mail：lixiu_tong2016@163.com。李懿璞和童丽秀为同等贡献作者。通信作者于晓芳，E-mail：yuxiaofang75@163.com。通信作者徐明良，E-mail：mxu@cau.edu.cn。通信作者高聚林，E-mail：nmgaojulin@163.com
（责任编辑 李莉）
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