王颖怡，吴玉田，孟春杨，周贻兵，刘利亚
贵州省疾病预防控制中心（贵阳 550004）
球虫是一种寄生孢子虫，可寄生于畜、禽肠道壁细胞[1]。其可宿主动物包括家禽如猪、兔、羊、牛及其他动物[2-4]。球虫病是家禽中最为常见且侵害性最强的一种寄生虫病，通常是由一种或多种球虫引起的急性流行性疾病。雏鸡或青年鸡的发病率和致死率可达80%，成年鸡一般不发病，但若携带球虫，其增重和产蛋能力降低。球虫繁殖力极强，当家禽受急性感染时，得不到及时治疗，死亡率会大幅上升。长期以来，球虫病的防治主要依赖抗球虫药物，全球每年用于防治球虫病的药物费用达3.2亿美元，然而由于球虫能够对几乎所有抗球虫药物产生耐药性，导致药物的防治效果较低甚至失效，因此增加用药剂量或者延长用药时间，可能造成在家禽体内的药物残留[5]，通过食物链的传递，进而危害消费者健康。
抗球虫药物的主要检测方法包括分光光度法、微生物法、色谱法等[6]，其前处理技术主要包括固相萃取净化[7]及QuEchERs净化技术[8]。经典的固相萃取方法虽然重现性稳定，但样品前处理步骤繁琐、成本较高，对操作者能力要求更高，而QuEchERs净化技术操作简便，处理过程简单，更适合大批量样品的快速筛查工作。因此，基于QuEchERs净化技术，建立鸡蛋中5种抗球虫药物HPLC-MS/MS残留确证分析方法，对随机抽取的33个批次市售鸡蛋进行分析，为抗球虫药物残留监管、风险评估提供参考，对确保动物源性食品安全具有重要意义。
1.1 仪器与设备
Agilent 1290型超高效液相色谱仪、Agilent 6470型三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；
3-30KS型高速离心机（德国赛多利斯公司）；
Milli-Q型超纯水机（美国密理博公司）；
IKA MS3型涡旋混匀器（德国IKA公司）；
T 460 H型超声波清洗器（北京博励行仪器有限公司）。
1.2 材料与试剂
尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亚砜、甲醇中托曲珠利-d3标准品（上海安谱实验科技股份有限公司）；
乙腈、甲醇（美国飞世尔试剂公司）；
CNWBOND PSA、CNWBOND HCC18填料（上海安谱实验科技股份有限公司）；
Agilent Bond Elut QuEChERS dSPE EMR-Lipid增强型脂质去除净化管[安捷伦科技（上海）有限公司]。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液制备
1.3.1.1 标准储备液
分别准确称取地克珠利、尼卡巴嗪、托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亚砜于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，其中尼卡巴嗪及地克珠利用乙腈定容，吸取适量的标准储备液分别配制成质量浓度100 ng/mL的混合标准使用液和混合内标使用液，在4 ℃冰箱内保存。
1.3.1.2 甲醇中托曲珠利-d3（内标）储备溶液
准确移取1 mL 100 μg/mL甲醇中托曲珠利-d3标准溶液于10 mL容量瓶中配制成质量浓度为10 μg/mL的托曲珠利-d3标准储备溶液。
1.3.2 前处理方法
称取2 g均质试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入2 mL水涡旋混匀，加入10 mL乙腈，漩涡混合30 s，超声提取20 min。按10 000 r/min离心10 min（温度低于5 ℃）。上清液待转出。另取一15 mL离心管，加入250 mg HC-C18、50 mg PSA吸附剂和2 g无水硫酸钠，移入6 mL上述上清液，振荡1 min；
按9 000 r/min离心5 min，移取1 mL上清液转移至进样小瓶中检测。
1.4 仪器条件
1.4.1 色谱条件
色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18（RRHD，2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；
流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇溶液；
流速0.3 mL/min；
柱温40℃；
进样量5 μL。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
1.4.2 质谱条件
离子源模式：电喷雾离子源负离子模式（ESI-）。仪器参数：毛细管电压3 500 V，鞘气温度250 ℃，脱溶剂温度300 ℃，喷雾器35 psi，鞘气流速11 L/min；
采集模式采用多反应监测MRM模式，化合物质谱参数见表2。
表2 质谱参数
2.1 提取条件与选择
由于5种化合物均属于中等或弱极性物质，在水中的溶解度较低，根据相似相溶原则，分别考察乙腈、甲醇、酸化的乙腈溶液（含0.1%甲酸）及酸化的甲醇溶液含（0.1%甲酸）在鸡蛋中的提取效果。与甲醇溶液相比，乙腈溶液渗透性强，且具有较好沉淀蛋白的净化效果。经甲醇溶液提取的样品杂质较多，干扰对目标物的分析检测，而含0.1%甲酸的乙腈提取溶液可改善样品中目标分析物峰形，该混合溶剂既能有效提取样品中5种目标分析物，又能高效率沉淀蛋白，降低杂质干扰，最终选择含0.1%甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂。
2.2 净化剂的优化
QuEChERS方法与传统的固相萃取等方法相比具有快速、高效、成本低等优势，是动物源性食品中药物残留分析领域较为简便、快速的方法[9]。Agilent Bond Elut QuEChERS dSPE EMR-Lipid作为新型的脂质去除产品，首次被应用于QuEChERS方法，具有高选择性去除样品中脂类物质的优点，因此首先考察EMR-Lipid增强型脂质去除净化管在鸡蛋中的净化提取效果，尼卡巴嗪在检测过程中，EMR-Lipid净化管去除杂质效果不佳，抑制效应明显，回收率较低。此外，托曲珠利砜经PSA净化后无回收率，因此上述2种方法不适用于分析物的同时检测。选择合适的吸附剂类型是解决问题的关键，常用净化材料有PSA、C18、GCB等，PSA可有效吸附酚类、糖类、色素、有机酸，C18可吸附脂肪、脂类和一些矿物质等，GCB可去除色素和少量非极性干扰物[11]。由于鸡蛋中含有脂肪、蛋白质等物质，因此实验将C18与PSA混合作为吸附剂，对PSA和C18净化材料设置不同比例进行试验，对比相关比例及相应的回收率情况见图1。结果表明，C18250 mg、PSA 50 mg时，去除杂质效果更好，回收率较高，大多集中在80%～110%范围内。最终选择C18250 mg、PSA 50 mg为吸附剂的改良分散固相萃取法对样品进行净化。
图1 不同吸附剂对目标分析物回收率的影响
2.3 流动相的选择
分别考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液等不同洗脱体系对目标物分离能力。结果表明，使用甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相时，目标物有良好的色谱分离效果，色谱峰峰型更好，且有较好的响应值，在试验条件下，5种抗球虫药物混合标准品标准液中尼卡巴嗪、地克珠利、托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亚砜及托曲珠利-d3的MRM色谱图见图2。
图2 混合标准溶液的总离子流色谱图及提取离子色谱图
2.4 基质效应
基质效应的存在对分析仪器产生严重污染，目标物除外的其余成分影响其离子化效率，从而造成抑制或增强组分的信号响应，影响结果准确性。由于鸡蛋中富含蛋白质、脂类等物质，因此沿用由Matuszewski等[16]首次提出的析基质效应评估方法，即提取后添加法进行基质效应的考察，根据数学模型进行评估。
基质效应（ME）=Y/X×100% （1）
式中：Y为空白样品基质中标准品的平均响应值；
X为纯溶剂中加入相同含量目标物的平均响应值。
结果表明，托曲珠利、托曲珠利砜、托曲珠利亚砜、地克珠利、尼卡巴嗪的峰面积比值分别为78%，80%，80%，75%和96%。比值越接近100%，表明基质效应对结果影响越小；
比值大于100%，表明存在基质增强效应；
比值小于100%，表明存在基质抑制效应[13-16]。因此为减少基质效应对定量的影响，采用基质匹配标准曲线内标法定量。
2.5 线性范围、检出限、定量限
采用基质提取液配制一系列不同浓度的5种抗球虫药物混合标准溶液，在优化好的色谱条件、质谱条件下依次进样，内标法定量。以目标分析物定量离子对与内标物定量离子对的峰面积之比为纵坐标，样品中目标分析物的质量浓度为横坐标，绘制工作曲线。同时，试验采用在用空白样品加入低质量浓度的抗球虫药混合标准溶液，经上述方法处理测定，以响应值的3倍信噪比计算检出限，10倍信噪比计算定量限。由表3可知，5种目标分析物线性关系良好（R2＞0.99）。
表3 方法线性回归方程与定量限、检出限
2.6 准确度及精密度
分别对空白鸡蛋样品中进行3个不同水平的加标试验，每个水平平行测定6次，计算回收率及相对标准偏差。由表4可知，5种化合物在0.6，3.0和6.0 μg/kg 加标水平的回收率为79.5%～99.3%，相对标准偏差（SRSD）为3.2%～10.5%，表明该方法重复性良好，可满足实际检测的需要。
表4 方法的回收率和精密度（n=6）
2.7 实际样品的检测
对随机抽取的33个批次市售鸡蛋进行分析，其中托曲珠利砜检出1批次，检出率为3.0%，含量为58.0 μg/kg，超过GB 31650.1——2022《食品安全国家标准食品中41种兽药最大残留限量》规定的托曲珠利在禽蛋中限量标准，即10 μg/kg（以残留标志物托曲珠利砜含量计），反映出在生产养殖过程中，或出现抗球虫药物使用不规范，用药剂量较大，产蛋期未休药或休药不及时的现象，因此对人体健康存在一定风险。
建立鸡蛋样品中5种抗球虫药的QuEchER净化-高效液相色谱串联质谱法。通过对提取剂、流动相等条件进行优化，对EMR-Lipid增强型脂质去除净化管及不同净化剂净化效果进行评估，采用基质匹配的标准曲线定量，提高定量结果的准确性。方法具有操作简便、灵敏度高等特点，适用于禽蛋中5种残留抗球虫药物的筛查与监测。
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