王梦琪，罗定强，刘海静*（1. 陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 71046；
. 陕西省食品药品检验研究院，西安 710065）
黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch、三角叶黄连Coptis deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云连Coptis teetaWall.的干燥根茎[1]，收载于《中国药典》2020年版一部中，具有清热燥湿、泻火解毒的功效；
常用于治疗湿热痞满，泻痢，黄疸，目赤，牙痛等疾病[2]。黄连花薹为毛茛科植物黄连属黄连的干燥花序，春季开花，其花为淡黄色；
黄连的花期较短，一般为每年2～4月，在移栽后第2年春季开花，开花后会消耗植物大量养分，为了提高药用部分（根茎）的产量，黄连生产基地除了会将少数黄连花薹留种外，其余均摘除丢弃，造成了资源的浪费。现代药理学研究表明，黄连花薹具有抗氧化、润肠通便和保护心肌缺血再灌注损伤等药理作用[3-5]，具有良好的开发利用价值。目前在黄连种植基地已将黄连花薹开发成花茶保健品供应于市场[6-7]，但是黄连花薹的化学成分还未得到充分研究，与其根茎的物质基础和作用机制差别也不明确，同时又缺乏相关的质量控制与评价方法，从而造成了黄连植物资源的浪费。基于我国“绿色发展”及“资源综合利用”的发展理念，为了综合利用黄连中药材资源[8]，本文以黄连花薹为研究对象，采用薄层鉴别法（TLC）与高效液相色谱法对比，寻找出黄连药材与黄连花薹中含量最大的差异性成分，采用聚酰胺柱层析等分离手段对黄连花薹与黄连药材差异性成分进行提取分离纯化，并采用液质联用以及核磁鉴定的方法对差异性成分进行确证，同时建立一测多评法（QAMS）[9]测定黄连花薹中酚酸类（绿原酸）、黄酮类（蒙花苷、芦丁）、生物碱类（小檗碱）4个成分的含量，并进行方法学验证，为黄连花薹质量评价提供参考。
1.1 仪器
AVANCE 3HD 600 MHz 型核磁共振波谱仪（美国布鲁克公司）；
LC-2030C 3D高效液相色谱仪（日本岛津）；
e2695高效液相色谱仪（美国Waters）；
质谱仪AB 5500＋（美国AB公司）；
UV-2550紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；
ME-204电子分析天平（梅特勒-托利多仪器公司）；
BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；
高纯水仪 UPH-Ⅱ-10T（四川优普超纯科技有限公司）；
数控超声仪（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）；
旋转蒸发仪（LABORIA4001，德国Heidoph公司）。
1.2 试药
乙醇（工业乙醇）、乙腈（色谱纯）（霍尼韦尔国际公司），高纯水、磷酸（分析纯）（天津市科密欧化学试剂有限公司），三乙胺（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），聚酰胺（30～60目，国药集团化学试剂有限公司）。对照品绿原酸（批号：11053-202018，纯度：96.1%）、芦丁（批号：100080-201610，纯度：91.9%）、盐酸小檗碱（批号：110713-202015，纯度：85.9%）、蒙花苷（批号：111528-201710，纯度：96.6%）（中国食品药品检定研究院）。
黄连花薹采自陕西省安康市南皋县、重庆市石柱县，经陕西省食品药品检验研究院中药室主任罗定强主任药师鉴定为毛茛科植物黄连（Coptis chinensisFranch）的干燥花序。
2.1 提取
取黄连花薹样品700 g 粉碎，过二号筛，以85%乙醇溶液回流提取3次，8倍量溶剂，每次1.5 h，合并滤液，真空减压干燥，得到总浸膏（191 g），备用。
2.2 聚酰胺柱层析分离与纯化[10-14]
用少量的5%乙醇溶液溶解黄连花薹浸膏50.04 g，加入已处理好的聚酰胺，水浴上低温挥去溶剂，干法上样，柱规格为 6.0 cm×100 cm，有效柱长 88 cm，分别用95%水-乙醇、90%水-乙醇进行梯度洗脱，洗脱过程每100 mL收集馏分，用TLC跟踪检查，合并Rf值相似馏分，减压浓缩至干，趁热加入少量20%乙醇溶液使溶解，放置室温后转入冰箱内进行低温析晶，静置过夜后得到大量晶体，抽滤后，得到化合物Ⅰ（116.5 mg）。将所得晶体经 HPLC 法测定，利用峰面积归一化法，测定纯度＞95%。
2.3 结构鉴定
化合物Ⅰ为淡黄色无定型粉末，纯度为95%；
分子式为C28H32O14，ESI-MSm/z：593.1（[M＋H]＋）；
1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.92（s，1H，5-OH），8.06（d，J＝8.9 Hz，2H，H-2"，6"），7.16（d，J＝8.9 Hz，2H，H-3"，5"），6.96（s，1H，H-3），6.80（d，J＝2.5 Hz，1H，H-8），6.46（d，J＝2.5 Hz，H-6），5.45（m，1H，-OH），5.24（d，J＝5.0 Hz，1H，-OH），5.21（m，1H，-OH），5.07（d，J＝7.4 Hz，1H，H-1""），4.71（m，1H，-OH），4.62（m，1H，-OH），4.56（s，1H，H-1"""），4.47（m，1H，-OH），3.87（s，3H，4"-OCH3），3.86（s，1H，H-6""），3.68（m，1H，H-2"""），3.62（m，1H，H-5"""），3.45（m，1H，H-3""），3.45（m，1H，H-6""），3.42（m，1H，H-5"""），3.33（m，1H，H-3""），3.29（m，1H，H-2""），3.17（m，1H，H-4""），3.15（m，1H，H-4"""），1.09（d，J＝6.3 Hz，3H，H-6"""）；
13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：18.30（C-6"""），56.06（4"-OCH3），66.57（C-6""），68.81（C-5"""），70.07（C-4""），70.83（C-3"""），71.22（C-2"""），72.53（C-4"""），73.55（C-2""），76.14（C-5""），76.73（C-3""），95.26（C-8），100.13（C-1""），100.40（C-1"""），101.01（C-6），104.30（C-3），105.94（C-10），115.20（C-3"，5"），123.16（C-1"），128.95（C-2"，6"），157.46（C-7），161.63（C-5），162.92（C-4"），163.44（C-9），164.43（C-2），182.53（C-4）。以上波谱数据与已知化合物Ⅰ的谱图数据[15]一致，确认为蒙花苷（linarin），结构式见图1。
图1 化合物Ⅰ的化学结构式Fig 1 Chemical structure of compound Ⅰ
图2 混合对照品（A）和黄连花薹样品（B）的HPLC图谱Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A）and Coptis chinensis flower moss sample（B）
3.1 对照品溶液的制备[16-20]
精密称取绿原酸对照品5.92 mg置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到质量浓度为0.2368 mg·mL－1储备液；
精密称取芦丁对照品6.18 mg置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到质量浓度为0.1236 mg·mL－1储备液；
精密称取盐酸小檗碱对照品7.16 mg置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到质量浓度为0.2864 mg·mL－1储备液；
精密称取蒙花苷对照品3.46 mg，置25 mL量瓶中，分别加入绿原酸、芦丁、盐酸小檗碱储备液2 mL、3 mL、5 mL，配制成含绿原酸0.018 21 mg·mL－1、芦丁0.013 63 mg·mL－1、盐酸小檗碱0.049 20 mg·mL－1、蒙花苷0.1337 mg·mL－1对照品混合溶液（注：储备液配制浓度为原始浓度，混合对照品溶液配制浓度均已进行折算）。
3.2 供试品溶液的配制
取6批黄连花薹样品各 0.2 g，分别加入70%乙醇25 mL，称量，超声处理（500 W，40 kHz）45 min，取出，放冷，再称量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3 色谱条件
采用资生堂C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（每1000 mL加20 μL三乙胺）（B）为流动相，梯度洗脱（0～27 min，92%B；
27～45 min，92%→80%B；
45～50 min，80%→77%B，50～65 min，77%B→73%B，65～70 min，73%→20%B，70～72 min，20%→92%B，72～75 min，92%B），流速 1.0 mL·min－1，检测波长340 nm，柱温 40℃，进样量 10 μL。
3.4 方法学考察[21-24]
3.4.1 系统适用性试验 在“3.3”项色谱条件下，4个待测成分的理论塔板数均大于5000，且色谱峰峰形良好，与相邻峰的分离度大于 1.5。混合对照品及黄连花薹样品色谱图见图 2。
3.4.2 线性关系考察 取“3.1”项下混合对照品溶液适量，稀释成系列浓度混合对照品溶液（绿原酸：0.018 21、0.036 42、0.091 05、0.1821、0.2732 μg；
芦丁：0.013 63、0.027 26、0.068 15、0.1363、0.2044 μg；
盐酸小檗碱：0.049 20、0.098 40、0.2460、0.4920、0.7380 μg；
蒙花苷：0.1337、0.2674、0.6685、1.3370、2.0055 μg），每个质量浓度平行测定3次，以对照品质量X和平均峰面积Y进行线性回归分析，得到回归方程及相关系数，结果见表1。
表1 线性关系考察Tab 1 Linearity
3.4.3 相对校正因子计算 取“3.1”项下混合对照品溶液，分别进样 1、2、5、10、15 μL进样测定，按公式[相对校正因子（fsi）＝（As×Wi）/（Ai×Ws）]（As为内标物质峰面积，Ws为内标物质的质量浓度，Ai为其他待测组分的峰面积；
Ws为其他待测组分的质量浓度）计算盐酸小檗碱对绿原酸、芦丁、蒙花苷的相对校正因子，结果见表2。
表2 黄连花薹中4个成分的相对校正因子结果Tab 2 Relative correction factors of 4 components in Coptis chinensis flower moss
3.4.4 精密度试验 取“3.1”项下混合对照品溶液10 µL，连续进样6次，计算得绿原酸、芦丁、盐酸小檗碱、蒙花苷峰面积RSD分别为 0.99%、1.1%、0.09%、0.43%，表明仪器精密度良好。
3.4.5 稳定性试验 取同一黄连花薹供试品溶液，分别于0、5、10、15、20、25、30、35、40 h进样分析，平行测定3次，记录峰面积，计算得到40 h内绿原酸、芦丁、盐酸小檗碱、蒙花苷色谱峰峰面积的RSD分别为1.9%、0.97%、1.2%和1.1%，表明供试品溶液在40 h内稳定性良好。
3.4.6 重复性试验 取同一批黄连花薹样品，每份 0.2 g，共 6 份，精密称定，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，得到6份样品绿原酸、芦丁、盐酸小檗碱、蒙花苷的平均含量分别为2.2486、1.9353、6.1675、21.5566 mg·g－1，RSD分别为0.59%、0.31%、0.32%、0.28%，表明此方法重复性良好。
3.4.7 加样回收试验 取已知含量的黄连花薹样品适量，每份约 0.1 g，共 9 份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入相当于含有量80%、100%、120%的混合对照品溶液，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果4种成分的平均加样回收率在 94.88%～96.68%，RSD均小于3.0%，表明该方法的准确性较好。
3.4.8 QAMS法与外标法测定结果的比较 取6批黄连花薹样品各2份，分别按“3.2”项下方法制备供试品溶液，以“3.3”项下色谱条件进样测定，采用QAMS法和外标法（ESM）计算各成分含量。结果表明，QAMS法与ESM法测得绿原酸、芦丁、蒙花苷含量基本一致，验证了采用QAMS法测定黄连花薹中含量具有可行性，见表3。
表3 QAMS与外标法ESM测得黄连花薹中4个成分的含量比较结果(mg·g－1，n＝3)Tab 3 Content of 4 components in Coptis chinensis flower moss measured by QAMS and ESM (mg·g－1，n＝3)
3.4.9 校正因子耐用性考察
① 不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响：分别考察 Waters 2495、岛津LC-2030C 3D、安捷伦1260 型 3种高效液相色谱仪及Agilent TCC18、Kromasil 100-5C18、资生堂C183 种色谱柱对相对校正因子的影响，结果RSD均＜3.0%，表明不同仪器和色谱柱对相对校正因子无明显影响，结果见表4。
表4 不同条件对相对校正因子的考察结果Tab 4 Relative correction factors under different conditions
② 不同流速对相对校正因子的影响：采用Waters e2695高效液相色谱仪和资生堂C18，分别考察流速为0.8、1.0、1.2 mL·min－1对相对校正因子的影响，结果RSD均＜3.0%，表明不同流速对相对校正因子无明显影响，结果见表4。
③ 不同柱温对相对校正因子的影响：采用Waters e2695高效液相色谱仪和资生堂C18色谱柱，分别考察不同柱温30、35、40℃时的相对校正因子。结果表明不同柱温对相对校正因子无明显影响，结果见表4。
4.1 黄连花薹特征成分的选择
通过两种不同的TLC系统：① 固定相为聚酰胺薄膜，展开剂为50%乙醇；
② 固定相为硅胶G，展开剂为乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（7∶3∶1∶1），显色剂为1%三氯化铝乙醇试液，加热，置365 nm下观察，发现了与黄连药材明显不同的清晰斑点；
又通过HPLC法，对比找出与黄连药材不同的色谱峰，其峰面积占黄连花薹峰面积的22.62%，故将其作为黄连花薹与黄连药材的差异性成分。采用正交试验设计法考察提取时间（1 h、1.5 h、2 h），乙醇浓度（70%、85%、95%），溶剂用量（6倍、8倍、10倍）三因素三水平对黄连花薹差异性成分提取率的影响，结果显示，在70%乙醇浓度，加入8倍量溶剂，提取1.5 h，得到黄连花薹差异性成分的出膏率最高。
4.2 检测波长的选择
根据各成分在紫外吸收谱图来确定检测波长。绿原酸在326 nm处有最大吸收，芦丁在354 nm处有最大吸收，盐酸小檗碱在344 nm处有最大吸收，蒙花苷在332 nm处有最大吸收，混合对照品在340 nm处响应值较好，故最终选择340 nm 作为检测波长。
4.3 内参物的选择
盐酸小檗碱是2020年版《中国药典》规定的黄连质量控制的指标性成分，而且其在供试品溶液中含量较高，性质稳定，较易获得，故选择为内参物。
4.4 供试品溶液制备方式的考察
本研究考察了提取溶剂、提取方式、提取体积、提取时间对黄连花薹特征成分提取效果的影响，结果显示超声提取法对特征成分的提取率较高，考虑到超声法操作简便，节省时间，以及酚酸类化合物的不稳定性（待测成分中有绿原酸），最终选择70%乙醇超声提取45 min作为提取条件。
4.5 色谱条件的优化
本研究考察了采用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1% 磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）溶液作为流动相对 4个待测成分含量测定结果的影响，结果显示用乙腈-0.1% 磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）时的峰形效果较好，故选择溶液乙腈-0.1%磷酸（每1000 mL加入20 μL的三乙胺）为流动相。考察不同梯度洗脱程序，在最终确定的色谱条件下，4个待测成分峰形良好，理论塔板数均大于5000，待测成分间以及与样品中其他成分之间的分离度良好。
4.6 指标的选择
2020年版《中国药典》中以盐酸小檗碱的含量来控制黄连药材的质量，规定以盐酸小檗碱计，含小檗碱不得少于5.5%，测定的黄连花薹样品中盐酸小檗碱含量在0.626%～0.679%，仅用盐酸小檗碱作为黄连花薹的质量控制指标专属性较差，同时蒙花苷为黄连花薹与黄连药材的差异性成分，在测定4个化学成分中含量最高，并且与黄连药材相比具有专属性。蒙花苷具有较好抗炎、抗氧化活性，可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，对肝、肾等器官有保护作用，可调节骨代谢，还具有降血压、抑制胆碱酯酶活性等药理作用，说明黄连花薹极具开发利用价值[25]。由于芦丁、绿原酸在黄连花薹中成分含量较高且易于测定，因此本文选择用芦丁、绿原酸、盐酸小檗碱、蒙花苷作为黄连花薹测定的指标性成分。
迄今为止，黄连药材的化学成分、药理作用等已有相关的研究，但是对于黄连花薹的化学成分、药理活性等方面的研究涉及甚少，且其具有降脂、降糖、抗氧化的作用，与黄连药材的治疗功效有所不同。于是，本研究选择黄连花薹作为研究对象，寻找并分离了黄连药材与黄连花薹中不同的化学成分，建立了QAMS同时测定黄连花薹差异性成分及其他3个成分的含量，可用于黄连花薹的质量控制，为开发黄连花薹提供参考。
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