邝晓岚，蔡婉娜，马婷，刘博，徐方方（广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510006）
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，根据不同的组织形态学和病理学表现可将其分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中非小细胞肺癌占肺癌病例的75%～80%[1]。超过80%的非小细胞肺癌患者被确诊时已处于中晚期，5 年生存率仅为15%[2]。目前非小细胞肺癌的治疗仍以手术、放疗和化疗为主，但其复发率及转移率高，且存在术后并发症、药物不良反应和耐药性等问题[3]。中药具有多成分、多靶点的治疗特点，在改善肺癌患者临床症状、提高生存质量以及延长患者生存期等方面具有独特的优势[4]。因此，探寻非小细胞肺癌的中医药治疗方法具有重要意义。
中药枳椇为枳椇属鼠李科植物，该属植物主要包括北枳椇（HoveniadulcisThunb．）、枳椇（Hovenia acerbaLindl.）以及毛果枳椇（HoveniatrichocarpaChun et Tsiang）等[5]。枳椇属植物入药部位为果实、木汁和木皮，其主要成分为黄酮类、三萜类以及苯丙素类[6]。研究[7]表明，枳椇子提取物具有较强的抗肿瘤活性。枳椇子95%乙醇提取物对人非小细胞肺癌A549 细胞的体外增殖具有良好抑制效果[8]；
枳椇子水提物能抑制H22 小鼠肿瘤组织生长[9]；
枳椇属三萜类成分hovenidulciosides C 能抑制A549 细胞中Nrf2 的表达[10]。Nrf2 的高表达不仅与肿瘤恶性程度相关，也与肿瘤TNM 分期、淋巴结转移及远处转移密切相关[11-12]。上述研究提示，枳椇属三萜类成分具有治疗非小细胞肺癌的潜力。故本研究拟采用网络药理学方法及分子对接技术探讨枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的关键成分及作用机制，以期为非小细胞肺癌的临床治疗及药物研究提供参考。
1.1 枳椇属三萜类活性成分虚拟筛选 利用TCMSP数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php/）结合相关文献数据库检索、汇总枳椇属三萜类化合物。通过Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载枳椇属三萜类化合物的结构，数据库中未收载的成分使用Chemdraw V19.0 软件绘制，并以sdf 格式保存。使用Discovery Studio 软件计算各化合物的“类药性”参数，筛选出符合Lipinski “类药五法则”[13]的化学成分作为枳椇属三萜类活性成分。
1.2 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点获取 使用Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）检索“1.1”项下筛选出的枳椇属三萜类活性成分的作用靶点，选择物种为“Homo sapiens”。以“Non-small cell lung cancer”为检索词，使用GeneCards、OMIM、TTD 和PharmGkb等疾病数据库[14]检索、合并、去重后，得到非小细胞肺癌疾病相关靶点。使用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org）对上述靶基因名称进行确认和校正。将枳椇属三萜类活性成分作用靶点、非小细胞肺癌疾病相关靶点上传至韦恩绘图平台（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到二者的交集靶点（共同靶点），作为枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点。
1.3 潜在作用靶点的蛋白互作（PPI）网络构建 将“1.2”项下的交集靶点在线导入STRING 平台（https://string-db.org），设定物种为“homo sapiens”、 阈值≥0.900，获取枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点的PPI 网络关系。将结果下载为“tsv”格式文件，并导入Cytoscape V3.8.2 软件中构建PPI 网络，使用Cytoscape 软件中的CytoNCA 插件（V2.1.6）进行核心靶点筛选。
1.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 使用R 4.0.3软件中的“clusterProfiler”程序包对枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的核心靶点进行GO 功能及KEGG 通路富集分析。GO 功能富集分析包括生物过程（Biological process，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和细胞组分（Cellular component，CC）。结果根据阈值P＜0.05 进行筛选，对所得条目以气泡图进行展示，分析枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用机制。将筛选出的活性成分、核心靶点以及KEGG 通路（前20 条）通过Excel 软件建立相互作用关系，并使用Cytoscape V3.8.2 软件构建“活性成分-核心靶点-潜在通路”网络。
1.5 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌核心靶点的生物信息学预测 肺腺癌（LUAD）、肺鳞癌（LUSC）及大细胞癌是非小细胞肺癌最常见的3 种病理类型，其中肺腺癌和肺鳞癌是非小细胞肺癌的主要亚型，约占70%[15]。因此利用Ualcan 数据库（https://ualcan.path.uab.edu）获得核心靶点在肺腺癌或肺鳞癌中的表达情况并进行相关分析。对正常组织与肺腺癌或肺鳞癌组织的核心靶点表达差异分析采用独立样本t检验（以P＜0.05 为差异有统计学意义）。
通过Kaplan-Meier Plotter 在线数据库（https://kmplot.com/analysis/）进行生存分析，在工具栏“mRNA”中选择“Lung cancer”，选择“Auto select best cutoff”作为诊断分界点的确定条件，分析核心靶点对非小细胞肺癌患者5 年生存率的影响。采用用log-rank 检验分析核心靶点的表达水平与肺癌患者生存之间的相关性（以P＜0.05 为差异有统计学意义）。
1.6 分子对接验证 结合生物信息学预测结果，在核心靶点中选取与非小细胞肺癌关联性较高的4 个靶点作为受体，分别与潜在活性成分进行分子对接验证。从UniProt 数据库中检索靶点的3D 结构，选择已被验证且物种为“Human”的靶点，并以PDB 格式保存；
使用Pymol 软件中的GetBox 插件获得靶点的活性位点，并对蛋白进行去水、去配体、加氢等处理；
联合使用AutoDock Vina 及R 软件进行分子对接结合能计算，得到结合能最低的分子构型。
2.1 枳椇属三萜类活性成分 通过TCMSP 数据库结合相关文献数据库检索共获得42 个三萜类成分，通过Discovery Studio 软件计算各化合物的“类药性”参数，筛选出符合Lipinski “类药五法则”的枳椇属三萜类活性成分4 个，结果见表1。
表1 枳椇属三萜类活性成分的类药性参数Table 1 Drug-likeness parameters of active components of Hovenia triterpenoids
2.2 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点 通过Swiss Target Prediction 数据库共预测得到4 个枳椇属三萜类活性成分的285 个作用靶点。通过GeneCards、OMIM、TTD 和PharmGkb 数据库检索、筛选、去重得到5 916 个非小细胞肺癌的疾病相关靶点。通过韦恩分析（见图1），得到非小细胞肺癌的疾病相关靶点与枳椇属三萜类活性成分作用靶点的共同靶点（交集靶点）186 个，即枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点。
图1 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点Figure 1 Potential therapeutic targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer
2.3 潜在作用靶点的PPI 网络 通过STRING 数据库进行186 个交集靶点的PPI 分析，并将结果导入Cytoscape（V3.8.2）软件构建PPI 网络。利用CytoNCA（V2.1.6）插件工具通过2 次筛选，共获得核心靶点12 个，见图2。核心靶点包括STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2、 MAPK3、 MAPK1、 AKT1、 JAK1、 JAK2、EGFR、MAPK14 和IL2，上述靶点可能在枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌中起到关键作用。
图2 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的核心靶点筛选流程Figure 2 Screening flow chart of core potential targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer
2.4 GO 功能及KEGG 信号通路富集分析 结果见图3。枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点涉及1 161 个BP 条目，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶信号（phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、蛋白激酶活性的激活（activation of protein kinase activity）和磷脂酰肌醇介导的信号传导（phosphatidylinositol-mediated signaling）等；
39 个CC条目，主要包括局部粘连（focal adhesion）、细胞-基质连接（cell-substrate junction）、质膜筏（plasma membrane raft）等；
72 个MF 条目，主要包括磷酸酶结合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）和MAP 激酶活性（MAP kinase activity）等；
前20 条KEGG 信号通路主要包括EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抗性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、癌症中PD-L1 表达及PD-1 检查点途径（PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer）、JAK-STAT 信号通路（JAKSTAT signaling pathway）等。
图3 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的GO 功能及KEGG 通路富集分析Figure 3 GO and KEGG pathway enrichment analysis of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer
将筛选出的活性成分、核心靶点以及KEGG 通路（前20 条）通过Cytoscape（V3.8.2）软件构建“活性成分-核心靶点-潜在通路”网络，见图4。该网络由35 个节点（包括4 个关键成分、11 个核心靶点、20 条通路）和186 条边构成。化合物Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin 和Saponin H 的度值分别为2、3、5、9，STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2等多个靶点均与Saponin H 相连，提示其可能是治疗非小细胞肺癌的关键枳椇属三萜类成分。
图4 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的“活性成分-核心靶点-潜在通路”网络Figure 4 “Active components-core targets-potential pathways”network diagram of Hovenia triterpenoids in the treatment of nonsmall cell lung cancer
2.5 核心靶点在非小细胞肺癌中的表达情况及对患者生存率的影响 通过Ualcan 在线工具分析了TCGA数据库中515 例肺腺癌组织与59 例正常组织、503 例肺鳞癌组织与52 例正常组织中STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 的表达情况，结果见图5。与正常肺组织相比，SRC 的表达水平在肺腺癌和肺鳞癌中均明显升高（P＜0.05），STAT3 及GRB2 的表达水平则明显降低（P＜0.05）；
而PIK3CA 在肺腺癌中的表达水平相较于正常肺组织明显降低（P＜0.05），在肺鳞癌中的表达水平则明显升高（P＜0.05）。
图5 核心靶点在正常组织与肺腺癌/肺鳞癌中的表达情况比较Figure 5 The core targets expression in normal lung tissue compared with LUAD or LUSC tissue
采用Kaplan-Meier Plotter 数据库评估核心靶点STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 对肺癌患者5 年生存率的影响，生存分析结果见图6。结果提示，SRC［HR=1.47（1.21-1.79），P＜0.05］低表达、PIK3CA［HR=0.86（0.75-0.99），P＜0.05］及GRB2［HR=0.51（0.43-0.61），P＜0.05］高表达的肺癌患者5 年生存率更高。
图6 核心靶点对肺癌患者5 年生存率的影响Figure 6 Effect of core targets expression on the 5-year overall survival of lung cancer patients
2.6 分子对接结果 结果见表2。将4 个活性成分与核心靶点STAT3、SRC、PIK3CA 和GRB2 分别进行分子对接，预测其结合能力。一般来说，结合能低于-4.25 kcal·mol-1表明小分子对蛋白质具有特异性结合活性，低于-5.0 kcal·mol-1表明结合活性较好，低于-7.0 kcal·mol-1说明有强结合活性[16]。结果显示，4 个活性成分与4 个度值最高的核心靶点结合能均小于-4.25 kcal·mol-1，表明结合能力良好，其中Jujubogenin、Saponin H 与PIK3CA 的结合能最低（-8.7 kcal·mol-1），存在极强结合能力。
表2 枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的活性成分与核心靶点分子对接结果Table 2 Molecular docking results of active components-core targets of Hovenia triterpenoids in the treatment of non-small cell lung cancer
本研究以多个数据库为基础，采用网络药理学方法和分子对接技术筛选出Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin 和Saponin H 等化合物，可能是枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的活性物质。其中， Ceanothetric acid 具有抗微生物活性[17]；
Jujubogenin（酸枣仁皂苷元）是酸枣仁皂苷A、B、B1的皂苷元[18]。研究[19]表明，酸枣仁皂苷A 可以通过激活Fat4-HIPPO-YAP 通路，诱导A549 细胞衰老和凋亡，并且能抑制肺癌细胞增殖，从而发挥治疗非小细胞肺癌的作用。
通过对潜在作用靶点的PPI 网络进行2 次筛选，获得STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 等12 个核心靶点。STAT3 是一种促进细胞增殖与存活的原癌蛋白，可被不同细胞因子激活[20]。正常组织中STAT3为非活化状态，而在肿瘤细胞中被异常激活而过度表达[21]，活化的STAT3 会影响细胞的增殖、存活、凋亡和血管生成等生理病理过程[22]。研究[23]表明，槐花-金银花配伍能通过抑制STAT3 信号通路，进而抑制免疫抑制细胞因子的激活，增强免疫反应，显著抑制黑色素瘤小鼠的肿瘤生长。SRC 是第一个被发现的原癌基因，在许多细胞类型中广泛表达[24]，抑制SRC 可以下调非小细胞肺癌细胞中MMP-2/9 的表达[25]，而MMP-2/9 的过度表达与肺癌患者的不良预后密切相关[26]。PIK3CA 在非小细胞肺癌患者中的突变率为14.1%，且PIK3CA 突变可激活肿瘤细胞中的Akt 信号通路，促进肿瘤细胞增殖、浸润及转移[27]。GRB2 是酪氨酸激酶受体信号通路中的重要枢纽蛋白，可介导多条信号通路的激活，干扰细胞中GRB2的表达能显著抑制A549 细胞的增殖[28]，且GRB2 还可通过激活Akt 信号通路和上调MMP-2/9 的活性来促进非小细胞肺癌的迁移[29]。
KEGG 通路分析结果显示，枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用靶点主要涉及EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、癌症中PD-L1 表达及PD-1检查点途径、JAK-STAT 信号通路等相关通路。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）广泛应用于含有EGFR 激活突变的非小细胞肺癌患者的治疗，但是大多数患者易产生耐药性[30]，因而调控EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性通路，有利于非小细胞肺癌患者的治疗。JAK-STAT 是EGFR-TKIs 作用后触发的下游信号转导通路之一，其通过刺激有丝分裂导致细胞增殖和抑制凋亡[31]。PD-1/PD-L1是一种重要的免疫抑制分子，以PD-1/PD-L1 抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（ICIs）的应用能够有效延长肺癌患者的生存期，相较于化疗患者，经ICIs治疗的非小细胞肺癌晚期患者的5 年生存率提高5 倍以上[32]。
综上所述，枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的潜在作用机制可能是通过Ceanothetric acid、Hovenic acid、Jujubogenin、Saponin H 4 种关键活性成分，作用于STAT3、SRC、PIK3CA、GRB2 等核心靶点，通过EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、癌症中PD-L1 表达及PD-1 检查点途径，以及JAK-STAT信号通路等抵抗EGFR-TIKs 耐药性及调节免疫功能的相关信号通路实现的。然而，网络药理学技术是基于现有数据库进行的计算推测，相关结果仍需进一步的生物学验证。本研究初步探讨了枳椇属三萜类成分治疗非小细胞肺癌的分子机制，可为其临床应用及非小细胞肺癌的新药研发提供参考。
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