潘凤英， 刘露露， 孙大运， 郭泽西， 曲俊杰， 尹 玲
(广西壮族自治区农业科学院 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室， 南宁 530007)
细胞壁是植物抵御病原菌侵染的一道天然屏障，由多糖、蛋白质以及脂肪酸构成，其中90%是多糖，主要是纤维素、半纤维素和果胶类，它们由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等聚合而成。病原菌在与植物互作的过程中，会分泌大量的细胞壁降解酶(cell wall degrading enzymes,CWDEs)来解聚寄主植物细胞壁的多糖成分[1]，从而破坏植物细胞壁结构，使得病原菌在突破表皮障碍成功侵染寄主的同时也吸取了自身繁殖所需的营养物质[2-5]。其中，大多数的CWDEs是糖基水解酶(glycoside hydrolases,GHs)[6]。果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶和木葡聚糖酶都属于GHs家族成员。病原菌分泌的这些GHs通常在质外体与寄主植物发生相互作用，因此被称作病原菌的胞外效应蛋白或质外体效应蛋白。效应蛋白是植物病原菌分泌的、可以操控植物免疫反应的一类小分子蛋白质。近年来，对植物病原卵菌胞内效应蛋白的研究迅猛发展，特别是CRN(crinkling and necrosis protein)和RXLR(R:精氨酸; X:任意氨基酸; L:亮氨酸)两种类型的胞内效应蛋白[7]。
鉴于病原菌效应因子在与植物互作中发挥重要作用，效应因子的生物学功能研究将是解释植物与病原菌互作机理的关键因素。虽然相对胞内效应因子，胞外效应因子的研究起步较晚，但也取得了一定的研究进展。本文综述植物病原菌胞外效应因子GHs基因家族的分类、酶功能以及在病原菌侵染过程中发挥的作用等方面的研究进展，以期为深入研究更多GHs的功能提供参考，也为更好地在作物改良及病害防控策略中利用这些GHs家族成员提供思路。
GHs几乎存在于所有生物体中，是一类以内切或外切方式水解两种或多种含糖化合物(包括单糖苷、寡糖、多糖、皂甙和糖蛋白等)中的糖苷键，生成单糖、寡糖或糖复合物的酶。根据蛋白序列特征、蛋白结构相似性以及作用底物特异性，网址http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html及时更新信息，目前GHs分为173个家族，不同家族具有不同的酶活特性和作用底物。目前研究较多的已知酶活的病原菌GHs见表1。
表1 植物病原菌已知的GHs家族成员及其功能
1.1 几丁质酶
根据CAZYme数据库(http://www.cazy.org)中对GHs的分类，GH18、19和23这3个家族的GHs显示出几丁质酶活性。GH18广泛存在于真菌、细菌、昆虫、植物及动物中，科学家曾经认为GH19只存在于植物与链霉菌属中[20]，但研究发现GH19也存在于卵菌葡萄霜霉菌中[21]。几丁质酶可以催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺。到目前为止，几丁质酶在真菌生长、营养、寄生、毒力和真菌病害防治等过程中的作用已经被证实。稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)基因组编码15个几丁质酶，均属于GH18家族，这些酶的缺失导致病原菌毒力降低，抑制水稻活性氧的产生，增强水稻对稻瘟病菌的易感性，说明几丁质酶对稻瘟病菌定殖、抑制寄主免疫和发挥自身毒力至关重要[8]；
可可丛枝病菌(Moniliophthoraperniciosa)MpChis基因和灰色果腐病菌(Moniliophthoraroreri)MrChi基因编码的几丁质酶是一种催化失活的几丁质酶，虽然缺乏对几丁质的降解活性，但它在与可可互作的过程中不仅高表达，依然发挥毒力作用，还能够通过与几丁质寡聚体结合来阻止植物中几丁质触发的免疫反应[9]；
在大肠杆菌中表达纯化的苜蓿链霉菌(Streptomycesalfalae)GH19家族几丁质酶SaChiB，能以内切方式水解甲壳素和壳寡糖，并且可以强烈抑制灰葡萄孢菌、禾谷镰刀菌等6种测试病原真菌的生长，表现出广谱抑菌性[10]。
1.2 纤维素酶
纤维素酶是一种复合酶，催化纤维素中β-1,4-糖苷键的水解，在降解纤维素的过程中主要由外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶3种酶联合发挥作用[22]。根据CAZYme数据库的分类，GH5、GH6、GH7和GH45等4个家族的基因具有纤维素酶活性。马铃薯炭疽病菌(Macrophominaphaseolina)中克隆的β-1,4-内切葡聚糖酶EGL1，隶属于GH5家族，可以特异性水解纤维五糖[23]；
稻瘟病菌中GH6家族的纤维二糖水解酶MoCel6A，对磷酸溶胀纤维素(PSC)、β-葡聚糖和纤维寡糖衍生物的水解活性高于对纤维素的水解活性，其中最好的底物是纤维寡糖；
而GH7家族纤维二糖水解酶MoCel7A的酶活在29 mmol/L纤维二糖存在时就受到严重抑制[24]，MgEGL1则具有显著的内切葡聚糖酶活性[25]。
1.3 木聚糖酶
木聚糖酶，又名内1,4-β-木聚糖酶，可水解半纤维素木聚糖主链上的β-1,4键。木聚糖酶在真菌、细菌和原生动物中都有发现，主要存在于GH5、GH7、GH8、GH10、GH11、GH30和GH43等7个糖基水解酶家族中[26]。但目前在真菌中研究最多的是GH10和GH11两大家族。GH10家族木聚糖酶具有较大的分子质量(>30 ku)、低等电点、(α/β)8桶状结构，多以二聚体形式发挥催化活性。与GH11家族木聚糖酶相比，其稳定性强，但催化效率低[27]。黑酵母(Hortaeawerneckii)GH10家族耐热木聚糖酶HwXYL10A对榉木、甘蔗、玉米芯的木聚糖均具有较高的催化活性，其与纤维素酶协同作用显著提高酶解桑皮废弃物过程的产糖量[28]。黄色溶纤梭菌(Clostridiumclariflavum)的木聚糖酶rXyn2441GH10具有降解木质纤维素的能力，是一种中热木聚糖酶，其209位组氨酸是酶活的关键氨基酸[29]；
芽孢杆菌的GH10和GH11家族木聚糖酶的活性在热稳定、最适pH值范围都存在差距[30]。一种分解木聚糖的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)的GH10和GH11家族蛋白分别表现出木聚糖酶活性，然而活性模式存在差异，rGH10XynA在pH 6时表现出最佳活性，在45 ℃～50 ℃具有热稳定性，而rGH11XynB在更宽的pH范围内(pH 5～9)表现出活性，并且仅在45 ℃时具有热稳定性[30]。
1.4 木葡聚糖酶
木葡聚糖由一个β-1，4-连接的葡聚糖骨架组成，上面装饰有α-1，6-木糖残基、D-半乳糖、L-岩藻糖等不同的装饰物，是植物初生细胞壁的主要半纤维素成分[31]。木葡聚糖酶是一种重要的糖基水解酶类，可以水解以β-1,4-糖苷键结构为主的多糖，特别是特异性木葡聚糖。在CAZYme数据库中GH5、GH9、GH12、GH16、GH44和GH74等6个家族的基因具有木葡聚糖酶活性，其中GH12和GH74是目前研究较多的两个家族。不同家族的木葡聚糖酶在木葡聚糖底物上的作用位点也不相同，大多数木葡聚糖酶对没有支链的葡萄糖残基进行水解[32-33]，而GH74家族的木葡聚糖酶则作用于有支链的葡萄糖残基[34]。
黄单胞菌属(Xanthomonas)的木葡聚糖酶拥有高度精细的酶联反应，包括不同的活性(乙酰酯酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-木糖苷酶和木葡聚糖酶)、催化机制(反转和保留)、作用模式(内切和外切)和3D架构(多模块和四元排列)[31]。葡萄白腐病菌(Coniellavitis)的木葡聚糖酶CvGH74A和CvGH74B体外体内均具有高度的木葡聚糖水解活性[26]，大豆疫霉的PsXEG1属于GH12家族，具有木葡聚糖酶和β-葡聚糖酶活性[17]；
灰霉病菌(Botrytiscinerea)的木葡聚糖酶BcXYG1也具有木葡聚糖酶活性[18]；
米曲霉(Aspergillusoryzae)的木葡聚糖酶Xeg12A和Xeg5A分别属于GH12和GH5家族，这2种酶的活性模式不同，Xeg12A是一种典型的内解离型木葡聚糖酶，可重复木葡聚糖的水解和解吸，相反，Xeg5A充当内切型木葡聚糖酶，可逐步水解木葡聚糖而不会解吸[35]。一些结构特殊的木葡聚糖酶具有特殊的水解位点，例如烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的木葡聚糖酶AfXEG74没有碳水化合物结合结构域(CBM)，当连接到缺乏半乳糖基分支的区域时，沿着XX基序在特定位置切割未取代的葡萄糖和木糖取代的葡萄糖之间的木葡聚糖骨架[36]。木聚糖酶酶活与其在病原菌侵染过程中的毒力是否存在相关性，目前的研究结论不一。例如，葡萄白腐病菌的木葡聚糖酶CvGH74A和CvGH74B毒力作用依赖于酶活[19]；
而大豆疫霉的木葡聚糖酶PsXEG1和灰霉病菌的BcXYG1毒力作用不依赖于其酶活性[17-18]。
GHs虽然在细菌、真菌等微生物中广泛存在，但并非所有微生物都具有所有糖苷水解酶的基因，GHs在不同基因组中分布的种类和丰度也有所不同。迄今为止，在真菌中检测到的最普遍的几个GHs家族是GH5、GH13、GH31和GH61，GH16和GH18家族的许多成员在90多种真菌中也都存在，但是在植物和细菌中扩增的GH19家族[37-38]，在昆虫病原真菌蛹虫草中却只有一个成员[39]。在其他真菌中常见的GH29、GH30、GH44、GH54、GH62和GH67等家族基因在镰刀菌(Fusariumvirguliforme)基因组中是缺失的，但在其他植物病原真菌或卵菌中没有报道或报道较少的GH131家族则在镰刀菌中存在[40]。植物病原真菌通常具有小的GH1、GH30家族[6,39,41]，与此相反，迄今为止测序的大多数卵菌中GH1和GH30家族基因数较多[42]，例如，寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)中含有17个GH1家族蛋白和21个GH30蛋白[43]。GH5家族是许多活体营养、半活体营养和死体营养真菌和卵菌中最大的GH家族之一。例如，活体营养型小麦锈菌和半活体的希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum)和寄生疫霉中都含有20多个GH5蛋白[39,41,43]。
子囊菌(Ascomycota)和担子菌(Basidiomycota)在一些GHs家族成员的丰度上也有所不同，子囊菌的GH2、GH72和GH76家族成员比担子菌显著多，但担子菌中GH5和GH79家族显著多[38]。子囊菌大量表达与植物相互作用相关的酶类，如GH1、GH3、GH5、GH7、GH12、GH9、GH44、GH45、GH74、GH10、GH16、GH8、GH26、GH11和GH30，它们都具有广泛的植物生物质降解能力，这将促进植物细胞壁的渗透以进行定殖[38]。2个深色有隔内生真菌[枝孢菌(Cadophorasp.)和大棘黑团孢(Periconiamacrospinosa)]基因组与另外32种不同生活方式的子囊菌进行测序和分析发现，GHs家族是2个基因组中发现的最具代表性的CAZymes类别，其中以GH3、GH16、GH18和GH43数目居多；
虽然GH78家族的基因数量也很高，但其仅存在于枝孢菌基因组中[44]。
致病菌根腐丝囊霉(Aphanomyceseuteiches)与非致病菌变形藻丝囊霉(Aphanomycesastaci)的基因组测序与分析发现，致病菌与非致病菌的GHs家族存在较大差异：根腐丝囊霉的GHs家族与卵菌(如疫霉属)的相近，但变形藻丝囊霉编码的GHs家族数量仅为根腐丝囊霉的三分之一；
根腐丝囊霉编码GH62家族，而变形藻丝囊霉不编码GH54和GH62；
根腐丝囊霉基因组大量表达了靶向植物特异性多糖(半纤维素、果胶)的酶基因，例如，半纤维素酶(GH10、GH11、CE4家族)、果胶酶(GH28、PL1、PL3和PL4)、内切纤维素酶和纤维二糖水解酶的GH7家族，而变形藻丝囊霉基因组缺乏编码这些酶类的基因，说明这些酶类可能在根腐丝囊霉成功侵染植物的过程中发挥重要作用[9]。
另外，植物病原菌GHs家族在基因组中的种类、数量和分布特征与其营养类型密切相关[45]。根据现有研究，本文总结了部分已测序的不同营养类型的植物病原菌GHs数量差异(表2)。根据这些数量差异，我们发现，与所有半活体和死体营养的植物病原菌相比，活体营养的病原菌基因组编码的GHs数量要少得多。活体营养的葡萄霜霉菌和番茄叶霉菌缺乏GH74家族编码蛋白，该蛋白具有木葡聚糖酶活性，可降解植物细胞壁木葡聚糖，促进病原菌成功侵染寄主[19,21,44]。因为活体营养的病原菌自身缺乏一些代谢途径，需要汲取寄主营养以满足自身需要，所以我们推测这些活体营养病原菌分泌较少数量的GHs帮助其成功侵染，但又不影响寄主的正常生命活动，使得寄主可以持续为其提供营养。此外，还有研究表明，在半活体营养类型的病原菌从活体阶段向死体营养阶段转变的过程中，GHs家族基因大量表达，促进其营养方式的转变[46]。
表2 不同营养方式植物病原菌基因组中糖基水解酶基因的数量
GHs作为主要的植物病原菌CWDEs，通过水解植物细胞壁来获取自身生长繁殖的营养或者产生一些有毒的次生代谢物，进而帮助病原菌侵染寄主植物。研究表明，GHs家族蛋白在病原菌侵染过程中的作用不尽相同。
3.1 作为毒力因子/致病因子促进病原菌侵染
研究表明，GHs充当毒力因子，参与病原菌感染寄主植物的过程。内切木聚糖酶基因xynB已被证明影响水稻白叶枯病菌的毒力[54]，灰葡萄孢的木聚糖酶Xyn11可以诱导植物叶片细胞死亡，并且是灰葡萄孢的毒力所必需的[12]。核盘菌的内切β-1，4-木聚糖酶SsXyl1缺失菌株产生异常的菌核，该菌核不能萌发形成子囊盘，并且对宿主也失去毒性[13]。苹果腐烂病菌(Valsamali)中GH10家族的内切β-1,4-木聚糖酶VmXyl1的缺失，虽然不影响菌丝生长，但显著减少了分生孢子的形成，降低了对苹果叶片和嫩枝的毒力[14]。在烟草疫霉中，发现两种GH10木聚糖酶ppxyn1和ppxyn2对烟草和番茄的毒力至关重要[15]。大豆疫霉分泌的GH7家族蛋白PsGH7a对病原菌的毒力至关重要，缺失突变体导致病原菌毒力显著下降[16]。稻瘟病菌的GH6和GH7纤维素酶有助于渗透宿主表皮，并进一步帮助稻瘟病菌入侵；
GH6和GH7多重敲除的菌株，侵染宿主能力下降[11]。PsXEG1是大豆疫霉的毒力因子，对大豆疫霉致病性起重要作用[55]。
3.2 作为激发子或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)诱导植物抗性
一些GHs在病原菌侵染寄主植物过程中充当PAMPs。GH12家族蛋白PsXEG1，在大豆疫霉菌侵染过程中，不仅发挥毒力因子的作用，还能够作为激发子，诱发植物自身一系列的免疫反应[56]。灰霉孢菌GH12家族的一种木葡聚糖酶BcXYG1，可在双子叶植物中诱导强烈的坏死和抗性反应[18]。来自棉花黄萎病菌的两种具有纤维素酶活性的GH12蛋白VdEG1和VdEG3也被发现具有PAMPs的功能，并且可以在本氏烟中触发细胞死亡以及与其酶活性无关的免疫反应[57]。此外，来自尖孢镰刀菌的FoEG1，属于GH12家族蛋白，在寄主植物中其酶活性对尖孢镰刀菌的毒力作出贡献，并且还可以作为PAMPs来诱导植物防御反应[58]。来自灰葡萄孢的木聚糖酶BcXyl1也可以作为PAMPs促进毒力并同时触发植物免疫[59]。黄萎病菌的胶酸裂解酶VdPEL1和角质酶VdCUT11也被报道作为PAMPs促进毒力并同时触发植物免疫[57,60]。此外，还有一些GHs可以被植物受体直接识别为PAMPs，调控植物免疫反应。例如，真菌内聚半乳糖醛酸酶可以被拟南芥的富含亮氨酸重复序列类受体样蛋白(LRR-RLP) AtRLP42识别为PAMPs[61]；
乙烯诱导木聚糖酶被番茄LRR-RLPs的LeEIX1和LeEIX2识别，但只有LeEIX1可以诱导传递过敏反应信号[62]。从黄萎病菌中鉴定出一种新的乙烯诱导木聚糖酶VdEIX3，该蛋白被本氏烟NbEIX2识别为PAMPs，诱导本氏烟产生免疫反应[63]。
3.3 GHs将植物细胞壁降解为损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)诱导植物免疫
一些GHs不能被植物直接识别，而是通过感知在GHs作用下释放的细胞壁碎片作为DAMPs，调控植物的免疫反应。灰葡萄孢的半乳糖醛酸酶可以将多聚半乳糖醛酸水解为低聚半乳糖醛(oligogalacturonides,OGs)，OGs作为DAMPs，被植物WAK1(wall associated kinase 1)识别，触发植物防御反应[64]。黄萎病菌胞外角质酶VdCUT11诱导的植物免疫可能是通过植物细胞壁聚合物的降解导致的DAMPs释放来介导的[65]。同时，Ökmen等[66]发现番茄叶霉病病原褐孢霉(Cladosporiumfulvum)的CfGH17-1和CfGH17-5不直接诱导细胞死亡，而是在侵染番茄过程中，从宿主细胞壁中释放出一种被未知宿主植物受体识别的DAMPs，从而诱导宿主的基础免疫。稻瘟菌分泌的葡聚糖内切酶MoCel12A和MoCel12B通过降解水稻细胞壁的半纤维素，释放特异的寡糖分子。这些特异的寡糖分子可以被水稻细胞膜上的受体OsCERK1作为DAMPs而识别，并激活水稻细胞免疫反应[67]。
3.4 特异性结合或分解病原/微生物相关分子模式(pathogen/microbe-associated molecular patterns,P/MAMPs)抑制植物的免疫反应
在病原菌侵染植物的过程中，植物产生的水解酶如几丁质酶可以将病原菌细胞壁降解产生几丁质寡聚物，几丁质寡聚糖是典型的PAMPs，激活植物免疫反应，这就是几丁质触发的免疫，也是植物对抗病原菌的第一道防线。但狡猾的植物病原菌会进化出特殊的几丁质酶，来削弱宿主几丁质酶降解的能力，达到病菌保护自身、成功侵染的目的。例如，可可丛枝病菌(Moniliophthoraperniciosa)和可可灰色果腐病菌(Moniliophthoraroreri)分别进化出突变的几丁质酶MpChi和MrChi，虽然不具有降解几丁质的活性，但保留了结合几丁质的能力，并能够通过隔离游离几丁质片段来阻止植物中几丁质触发的免疫[9]。与上述两种病原菌几丁质酶的作用机理不同，瓜类白粉病菌(Podosphaeraxanthiii)的几丁质酶效应因子EWCAs (effectors with chitinase activity)定位在真菌吸器，在侵染部位植物的乳突中释放，分解几丁质寡聚物，从而阻止几丁质触发植物免疫的激活，帮助病原菌侵染植物[68]；
类似功能的几丁质酶效应子在稻瘟病菌和球腔菌中也有报道[8,69-70]。
自然界中，病原菌与植物一直进行着动态竞赛。植物通过物理屏障、先天性免疫和生理生化机制等多重屏障来逃避病原菌的侵染，而病原菌则通过各种各样的致病因子瓦解植物物理屏障、抑制植物先天性免疫来达到成功入侵定殖的目的。细胞壁是植物的第一道物理屏障，在病原菌与植物互作过程中，病原菌会分泌大量的细胞壁降解酶来解聚细胞壁的多糖成分，GHs是细胞壁降解酶中比较重要的一类。
目前，科学家们已初步研究一些植物病原菌GHs的功能，主要是在侵染过程中分解细胞壁，进而帮助其侵入定殖，发挥毒力作用，诱发寄主植物的免疫反应。Ma等[17]还通过GH12家族编码蛋白的研究发现了作物疫病发生的新机制：大豆疫霉在侵染植物早期，向胞外分泌糖基水解酶XEG1攻击植物细胞壁，而植物则利用水解酶抑制子GIP1抑制其活性；
在进化的过程中，病原菌又获得了XEG1的失活突变体XLP1，以诱饵“DECOY”的方式，竞争性干扰抑制子GIP1，与XEG1协同攻击植物的抗病性。与此不尽相同，稻瘟菌分泌的葡聚糖内切酶MoCel12A和MoCel12B通过降解水稻细胞壁的半纤维素，释放特异的寡糖分子，而这些特异的寡糖分子可以被水稻细胞膜上的受体OsCERK1作为DAMPs而识别，并激活水稻细胞免疫反应[67]。然而，GHs的研究仍存在许多问题需要解决。比如，GHs如何被致病菌分泌并进入寄主细胞发挥毒性作用？摸清GHs的转运机制，将对开发新的药物靶标、指导设计阻断GHs转运的植物病害防控策略提供重要理论依据。另外，植物病原菌基因组中编码的GHs存在大量冗余，根据它们的基因组序列，1个GHs家族成员往往有10个以上甚至20多个基因，现有的研究结果发现仅1个或少数的GHs基因对植物病原菌的毒力和侵染有重要作用，因此进一步的多基因家族的冗余性研究有助于筛选确定不同成员的特异性，探究其在病原菌-宿主互作过程中的作用。