李利山，刘玉香，韩斌*
（1.榆林市畜牧兽医服务中心 陕西榆林 719000；
2.佳县畜牧服务中心 陕西榆林 719200）
猪瘟（classical swine fever，CSF）俗称“烂肠瘟”“猪霍乱”，是目前危害我国养猪业最严重的传染性疾病之一，为我国一类动物疫病[1]，主要表现为出血和发热，任何年龄、品种、性别的猪和野猪均可发病，高死亡率，对生猪养殖场造成的损害大[2]。猪瘟首次报道于1810 年，1833 年在美国首次暴发，1935 年在我国开始流行。1912年研究表明采用高免血清和携有猪瘟病毒的血液共同对猪免疫具有一定的保护效果，但有一定的散毒风险[3]。1936 年美国研发出了猪瘟结晶紫灭活疫苗，1943 年全世界开始推广使用猪瘟结晶紫灭活疫苗，1951—1955 年我国开始使用结晶紫灭活疫苗对猪进行免疫。猪瘟结晶紫灭活疫苗由于产生免疫能力慢、免疫保护期短、需要培养强毒株、疫苗散布猪瘟风险大和生产成本高等原因在1982年开始停止生产。20 世纪70 年代—80 年代猪瘟原代细胞疫苗、2005 年猪瘟猪睾丸传代细胞疫苗、2018 年新型猪瘟疫苗基因工程亚单位疫苗等相继研究获得成功并开始推广使用[4]。据报道2020 年我国市场上共有60 余家生产企业获得猪瘟疫苗政府生产批文，批签发总数在1,400 多批。目前人们使用和研究的猪瘟疫苗主要为弱毒疫苗和新型猪瘟疫苗。
1946 年，国外研究者开始研制猪瘟病毒减弱的变异毒株。1950年，我国研究者培育出了一株免疫效果较好的猪瘟兔化弱毒株（C株或HCLV 株），它是石门系（shimen）强毒株通过大耳白兔传430代，历经4 年多研究成功的致弱疫苗株，由于其具有很好的安全性和免疫性，1956 年开始在国内推广使用，是我国主要使用的猪瘟疫苗毒株。到目前为止，猪瘟弱毒疫苗可分为动物组织源弱毒疫苗和细胞源弱毒疫苗。
1.1 动物组织源弱毒疫苗
从1957 开始使用成年兔脾脏及淋巴结（简称脾淋）组织弱毒疫苗，该疫苗是将猪瘟兔化弱毒株接种到兔体内，然后采集感染猪瘟病毒兔子的脾脏和淋巴结进行加工制备而成，据报道，每只成年兔可制成猪瘟疫苗300 头剂左右[5,6]。1964 年开始使用3～5 日龄的乳兔组织制备弱毒疫苗，1965 年研究者们发现将猪瘟病毒接种到1～2 岁的易感牛体内后，采集淋巴结和脾脏组织制成组织疫苗，免疫效果与兔的组织苗效果相似，并在部分区域开始应用，但由于使用牛成本高，疫苗效果不稳定，到2005 年后便逐渐减少使用。截至目前猪瘟组织疫苗主要还是成年兔和乳兔的组织弱毒疫苗。兔源组织源疫苗抗体产生快，免疫保护期长，疫苗中含有增强免疫因子，能够增强免疫效果，常用于紧急免疫[7]；
不足之处为生产成本高，适宜制作疫苗的兔源减少，不同批次家兔产出疫苗抗原含量有变化，在储运时均需在-15℃的条件下冷冻保存，实际应用中疫苗容易失活，造成免疫效果参差不齐，为此研究者们研发出了兔源猪瘟耐热保护剂活疫苗，这类疫苗加有耐热保护剂，生产出的猪瘟疫苗可在2～8℃环境中储存，且保存时间能够达到18 个月以上。
目前市场上也有售猪瘟多联疫苗，如猪瘟三联（猪瘟-猪丹毒-猪多杀性巴氏杆菌）弱毒疫苗（兔源+G4T10 株/GC42 株+EO630株），此疫苗是将猪瘟兔化弱毒株接种到乳兔体内，然后摘取含有病毒的乳兔组织进行研磨，再将猪丹毒杆菌弱毒液和猪源多杀性巴氏杆菌弱毒菌液进行混合制备而成。此类疫苗制备工艺要求较高，需要在猪瘟乳兔组织培养物中不含青霉素和链霉素。
1.2 细胞源弱毒疫苗
主要有乳猪肾细胞苗、羊肾细胞苗、犊牛睾丸原代细胞苗、猪睾丸传代细胞苗（swine testis cells，ST 细胞）、牛睾丸细胞传代细胞苗（bovine testis cells，BT 细胞）。
1）猪瘟原代细胞苗。将猪瘟病毒接种到原代细胞中培养，然后收毒制成冻干苗。2020 年获得政府批签发总数500 多批。1974 年研究者通过乳猪肾原代细胞成功研究出了猪瘟细胞源疫苗，1980年通过绵羊肾原代细胞制出了猪瘟绵羊肾原代细胞源疫苗，1982年通过奶山羊肾原代细胞制出了猪瘟奶山羊肾原代细胞源疫苗，1985 年研究者使用犊牛睾丸原代细胞制成了猪瘟牛睾丸原代细胞源疫苗。
猪瘟原代细胞苗优点是生产成本较低，生产量大，批间抗原含量好控制，价格便宜。不足的地方为免疫后抗体产生较慢，抗体量低，免疫时需要加大免疫剂量。另外如使用牛睾丸原代细胞培养，有牛病毒性腹泻病毒（BVDV）影响的风险，从而影响疫苗稳定性。
2）猪瘟传代细胞苗。传代细胞苗是用猪瘟病毒兔化弱毒株接种到易感传代细胞培养得到的。2020 年猪瘟传代细胞疫苗获得政府批签发总数为500 多批。2005 年研究者使用猪睾丸传代细胞制成了猪瘟传代细胞源疫苗，2008 年我国有16 个省市开始推广使用，是目前应用最多的一种弱毒传代细胞疫苗。使用猪睾丸传代细胞避免了异源细胞培养问题，且可以传代培养，抗原含量高，减少了使用牛血清带来的BVDV 污染问题[8]。在母源抗体较高的情况下免疫猪瘟传代细胞源疫苗，容易产生免疫失败现象，因此在免疫前需要对仔猪的猪瘟母源抗体水平进行监测。
目前我国猪瘟传代细胞疫苗主要由以下单位或企业研发成功，农业农村部2012 年通过了中国兽医药品监察所申请的猪瘟猪睾丸传代细胞苗，2015 年通过了华威特（北京）生物科技有限公司使用牛睾丸（BT）传代细胞制备的猪瘟二联活疫苗（猪瘟+猪蓝耳），2020 年通过了军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所使用PK/WRL 传代细胞制备的猪瘟传代细胞苗[9]。
猪瘟传代细胞苗多联苗有猪瘟二联弱毒疫苗（猪瘟-高致病性猪繁殖与呼吸综合征），该疫苗是将猪瘟兔化弱毒C 株接种到牛睾丸传代细胞培养后制成的疫苗，目前已上市。使用该种疫苗进行免疫能够减少免疫次数，减少猪只的应激反应和工人劳动成本，但对于已经感染猪瘟病毒的猪只或已经免疫过猪瘟病毒疫苗的猪只来说并不能够产生很好的保护效果。
新型猪瘟疫苗主要有亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、基因缺失苗和反式互补缺失突变疫苗[10]。
2.1 亚单位疫苗
猪瘟亚单位疫苗是指将猪瘟囊膜蛋白基因通过原核表达系统或真核系统进行表达成为蛋白对猪进行免疫。猪瘟病毒有3 种囊膜蛋白，分别为Erns（E0）、E1 和E2，结构糖蛋白-E2 蛋白，是猪瘟病毒侵入机体细胞的重要蛋白[11]，具有很好的免疫原性，能够诱导机体产生相应抵抗病毒抗体，因而为许多研究团队所重视。研究者们使用毕赤酵母、腺病毒、转基因哺乳动物细胞、杆状病毒和基因工程乳杆菌等表达E2 亚单位疫苗。有研究者通过使用HEK293T重组细胞表达出了免疫原性较E2 蛋白更好的E2-GM-CSF 融合蛋白为猪瘟疫病的防控提供了新型E2 亚单位疫苗[12]。颜仁和等[13]通过细胞系HEK-293T-E2 制备出猪瘟E2 亚单位疫苗，该疫苗能够诱导兔和仔猪产生猪瘟病毒抗体，能够抵抗猪瘟病毒石门株的攻击，仔猪阻断率在80%以上。高莹等[14]以猪瘟病毒E2 基因序列为基础，构建出了重组杆状病毒rAc-HE2oKm，对仔猪进行免疫后能够产生高水平的抗体，免疫效果与猪瘟活疫苗相当。王遵宝等[15]通过杆状病毒感染昆虫细胞后表达出E2 蛋白（Bac-E2），使用该亚单位疫苗对猪进行免疫发现Bac-E2 能够诱导猪产生较高的猪瘟中和抗体，免疫组在猪瘟病毒的攻击下保护率达到100%。
德国拜耳公司和荷兰英特威公司已通过两种杆状病毒表达出E2 蛋白亚单位疫苗，具有安全性，免疫原性好的特点，目前已经上市。我国天康生物股份有限公司在杆状病毒上重组猪瘟病毒E2 基因，然后在昆虫细胞上进行表达的亚单位疫苗（Rb-03 株）[16]。该疫苗在我国2017 年注册完成，2018 年开始生产使用。免疫实验表明经过两次免疫后，能够有效避免猪瘟病毒的伤害[17]。2020 年华中农业大学和一些企业合作研发出了猪瘟病毒E2 蛋白重组杆状病毒亚单位疫苗（WH-09 株），完成官方疫苗注册时间为2020 年，政府批签发数量12 批。该疫苗利用昆虫细胞-重组杆状病毒系统表达猪瘟E2 蛋白的基因工程亚单位疫苗，具有安全性好、稳定性强的特点。
2.2 活载体疫苗
活载体重组疫苗被许多研究者认为是潜力较大的一类猪瘟疫苗，主要使用的载体病毒有牛病毒性腹泻病毒、痘病毒、伪狂犬病病毒和猪腺病毒[18]。
2014 年欧洲药品管理局批准上市了牛病毒性腹泻病毒载体疫苗CP_E2alf 疫苗，CP7-E2alf 疫苗与弱毒活疫苗一样安全有效，防止了猪瘟病毒的垂直传播[19]。Voigt 等[20]使用重组口疮病毒ORFV VrV-E2 对猪进行免疫，结果表明具有很好的保护效果。李谱华等[21]将猪瘟病毒抗原较好的E2 基因构建到鸡痘病毒表达载体FPVP11 上，然后重组出鸡痘病毒FV282-CSFV-E2.对小鼠和猪分别进行了免疫，采用猪瘟病毒强毒株进行攻击，结果表明疫苗保护率在75%左右。杨玉艾等[22]利用腺病毒转移载体质粒PAdEasy-E0-E2构建出重组腺病毒rAd-E0-E2，对45 周龄的猪进行2 次免疫，使用猪瘟毒株进行攻毒，研究表明疫苗免疫保护率达到86%。梁易晓等[23]研究表明重组猪瘟腺病毒rAd-E0-E2 株活载体疫苗，能在短时间内通过细胞免疫或黏膜免疫等途径保护猪，免疫保护期至少为7 个月。韩爽等[24]重组出含有猪瘟E2 基因的重组伪狂犬病病毒PRV-CSFV PE2SC，该重组载体具有稳定遗传的能力，对猪瘟和猪伪狂犬病能够同时预防。
2.3 核酸疫苗
将猪瘟病毒基因构建到真核表达载体中然后使用该疫苗对动物进行免疫。郭抗抗等[25]构建出了含有猪瘟E2 基因的表达载体pSCA1-E2 质粒，使用核酸疫苗对小鼠和猪进行免疫，表明小鼠淋巴细胞增高，免疫猪能够产生猪瘟特异性抗体。有研究者使用DNA疫苗pSFV1SC-E2 对猪进行免疫后能够有较好的细胞免疫保护效果[26]。Andrew[27]将猪瘟病毒E2 基因组装到质粒上对猪进行免疫后能够产生一定的免疫效果。
2.4 合成肽疫苗
根据病原体基因组核苷酸序列推导出该病原体基因所要表达出的寡肽，然后制备成为疫苗对猪进行免疫。Zhou 等[28]合成了猪瘟E2基因所表达蛋白的B 细胞线性表位RE2-A 和RE2-B，使用该疫苗两次免疫后，动物机体能够产生相应抗体。Tian 等[29]构建了多个E2蛋白抗原表位的多肽苗，使用该疫苗能够很好的保护猪只。
2.5 基因缺失苗
有研究者将E2 蛋白抗原表位WH303 上的氨基酸进行突变，作为候选标记疫苗，能够区别疫苗免疫与非免疫。也有研究者构建了疫苗安全性好E0 缺失突变株，缺少66 个氨基酸的FL22 株和缺少215 个氨基酸的FL23 株[30]。
2.6 反式互补缺失突变疫苗
这类疫苗主要是在CSFV 的Erns 或E2 的反式互补缺失突变体，结构基因被外源基因代替。中国农科院哈尔滨兽医研究所研发的腺病毒甲病毒复制嵌合载体疫苗rAdV-SFV-E2 最具潜力，能够抵抗猪瘟病毒强毒的感染[18]。仔猪免疫后也具有很好的保护效果，能够不受母源抗体影响，具有很好的保护效果，该疫苗和猪伪狂犬疫苗联合免疫时免疫效果能够不被干扰影响。
目前最有效预防猪瘟的方法为疫苗免疫。弱毒疫苗免疫猪只后无法区分猪瘟毒株是来自疫苗免疫还是外界感染，免疫失败也时有发生，相比较之下，新型猪瘟疫苗具有安全性、稳定性、可识别性和疫苗生产、储存和运输成本低等优点，同时伴随着生物技术的发展和研究者们对猪瘟病毒的不断了解，新型猪瘟病毒疫苗终将会在猪瘟净化上发挥巨大的作用。■
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