续钊 ，张元馨 ，卢前明
(1.郑州职业技术学院，郑州 450121；
2.河南工程学院 资源与安全工程学院，郑州 451191)
玫瑰属于蔷薇科植物[1]，多年生常绿灌木，生长在阳光充足的地方，在全球各地尤其是在北半球地区被广泛栽培[2]。我国的玫瑰花栽培已经有近2000年的历史，主要栽培在甘肃、新疆、云南和山东等地，玫瑰属于我国重要的经济作物[3-5]。
玫瑰花除了具有特殊的香味外，还富含多种营养物质[6]，其中维生素、脂肪酸和多种矿物质化合物含量最为丰富[7]。已有研究表明[8]，在云南地区可食用玫瑰中主要的营养成分有维生素C、粗纤维和蛋白质[9]。而食用玫瑰中的营养成分和矿物质元素也多于普通的蔬菜，此外，食用玫瑰还可以作为补充人体微量元素和膳食纤维的食物[10-11]。
随着蔬菜、水果、种子和植物的根基不断被开发利用，消费者开始将眼光投向了食用花卉[12]。在一些亚洲国家，花卉也成为了药物和传统食物。将花卉加入食物中，不仅可以改善食物的外观，也能提高食物的营养价值[13-14]。玫瑰花在食品行业中可以用于制作果酱、果汁、醋、酒、奶油蛋糕和糖浆等[15-16]。玫瑰酱在发酵过程中，产生氨基酸、酚类和黄酮等风味物质，使得玫瑰酱不仅具有特殊的香味，也具有药用和保健功效[17]。
微生物是玫瑰酱发酵的核心，能够将玫瑰花中的一些营养物质转化为营养因子[18]。经过微生物发酵的玫瑰通常都具有微生物功能特性，从而提高食物本身的营养价值[19]。微生物群落结构在玫瑰酱发酵过程中有着至关重要的作用，对玫瑰酱的产品质量和口感均会产生明显影响。目前关于玫瑰酱中微生物的种类研究较少，玫瑰酱中的微生物群落结构也尚不清晰。所以，本研究基于此，对玫瑰酱中的微生物群落和结构进行了研究。
1.1 试验材料
选取3个国内较为传统的玫瑰酱产区，a1，a2为云南大理，a3，a4为山东平阴，a5为贵州贵阳。所有的样品在2020年采集，每个样品被平均分成4份，均保存在-21 ℃的冰箱中。
1.2 仪器和设备
高速离心机、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、PCR仪 上海仪器科技有限公司；
电泳仪、1 000 mL移液枪、恒温水浴锅 杭州旌斐仪器科技有限公司。
1.3 玫瑰酱制作工艺流程
1.3.1 工艺流程
烘干的玫瑰花→加入蒸馏水复原→加入柠檬水→打浆→调配→熬制→装罐→密封→杀菌→冷却→成品。
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 原材料选择
选择花瓣饱满、色泽鲜艳、香气浓郁的玫瑰花。将外层变黄的花瓣、花蕊和花萼去除之后用清水洗净备用。
1.3.2.2 复原
原材料整理结束之后，按料液比例为1∶4加入蒸馏水，在45 ℃的条件下加热使干玫瑰花复原20 min，冷却至室温，加入一定比例的柠檬水，混匀，调节溶液的pH为5.0。
1.3.2.3 打浆
用磨碎机将配好的玫瑰花瓣打浆处理，磨碎之后再使用胶体磨对原料进一步处理，使玫瑰花浆均匀细腻。
1.3.2.4 调配
将玫瑰花酱、甲基纤维素钠和琼脂混合均匀，用小火熬制，不断搅拌，搅拌期间不断加入蔗糖溶液，一直熬至玫瑰酱中40%为固形物，之后装罐密封。
1.3.2.5 杀菌
装罐密封之后，将玫瑰酱放入灭菌锅中，在100 ℃条件下加热5 min，之后将玫瑰酱取出，在自然条件下冷却，即制成玫瑰酱成品。
1.4 试验方法
1.4.1 玫瑰酱中微生物DNA的提取
采用宏基因组DNA试剂盒从玫瑰酱中提取1 mL样品，之后用浓度1%的琼脂糖凝胶，在电泳仪上对DNA质量进行测定。
1.4.2 PCR扩增与高通量测序
以提取的DNA作为模板，用引物341F和引物805R扩增DNA中的细菌，PCR条件：94 ℃预热4 min，94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸10 min。采用真菌的正向引物ITS1和反向引物ITS4扩增，PCR条件：94 ℃预热4 min，94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸 10 min。PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序完成。
2.1 玫瑰酱中微生物多样性分析
为了研究玫瑰酱中微生物的多样性，把玫瑰酱中进行宏基因组分析所获得的序列按照99%的相似性进行OTU分类，对玫瑰酱中微生物进行筛选之后，发现玫瑰酱中的细菌序列为32 122～120 312，一共有1 657个OTU，玫瑰酱中一共有真菌序列34 122～110 021，一共有2 109个OTU。
图1中A和B为玫瑰酱中的微生物稀疏性分析，5种发酵的玫瑰酱中真菌和细菌的稀疏性都比较平坦，结果表明，玫瑰酱中宏基因组测序数据较为合理。
图1 玫瑰酱中细菌稀疏性曲线(A)和真菌稀疏性曲线(B)Fig.1 Bacterial sparsity curve (A) and fungal sparsity curve (B) in rose sauce
玫瑰酱中的微生物多样性用Shannon指数、ACE指数、Chaol指数和Simpson指数进行分析，表示真菌和细菌在玫瑰酱中的多样性和丰富度见表1和表2。
表1 细菌在玫瑰酱中的操作分类学单元(OTUs)Table 1 Operational taxonomic units (OTUs) of bacteria in rose sauce
表2 真菌在玫瑰酱中的操作分类学单元(OTUs)Table 2 Operational taxonomic units (OTUs) of fungi in rose sauce
由表1可知，样本a2的ACE指数和Chaol指数相比于其他样本较高，分别为1 623.167和391.19，说明a2玫瑰酱样本中的细菌丰富度较高。在表2中，a1样本的ACE指数和Chaol指数比其他样本高，表明a1中的真菌多样性比其他样本高。
在表1中，a4样本的Simpson指数最低，为0.27，Shannon指数最高，为7.124，表明a4是玫瑰酱样本中细菌多样性最高的。在表2中，a2样本的Simpson指数最低，Shannon指数最高，分别为0.18和2.867，表明a2样本中真菌的多样性最高。
2.2 玫瑰酱中微生物群落结构分析
采用宏基因组对玫瑰酱中细菌多样性进行分析，玫瑰酱在门和属水平上的细菌多样性见图2，只有相对丰度值大于0.01%的细菌群落被展示在图2中。
图2 细菌群落在玫瑰酱中门(A)和属(B)水平上相对丰度基于99%的序列相似性Fig.2 Relative abundance of bacterial communities of rose sauce at the phylum (A) and genus (B) levels based on 99% sequence similarity
由图2中A可知，在自然发酵的5种玫瑰酱中，一共有31个门的细菌被检测出来，其中变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门3个菌门为优势菌。在5个不同的样本中，细菌优势群落存在一定的差异，a3样本中拟杆菌门的细菌明显多于其他4个样本，变形菌门的微生物量明显少于其他4个样本。先前的一些研究结果也表明[19]，发酵食品中优势细菌主要为变形菌门和拟杆菌门，这些结论与我们的研究结果也相近。
由图2中B可知，在属水平上，5种发酵产品中的假单胞属、泛菌属、罗森伯氏菌属、伯克氏菌属和劳尔氏菌属是明显的优势属，但是不同的样本中，优势属所占的比例有所差异。在5个样本中，假单胞属相比于其他菌群明显占有优势。这主要是由于玫瑰酱在发酵过程中，不同样本的发酵环境存在一定差异。
采用现代分类学，对玫瑰酱中的真菌多样性进行分析，结果表明，玫瑰酱中的真菌一共有10个门，38个纲，79个目，130个科和319个属。由图3可知，5个样本的玫瑰酱中，优势的真菌门为担子菌门、子囊菌门和其他未分类的真菌。在a5样品中，样品中的真菌基本都为担子菌类，a1样品中其他未分类的真菌所占的比例相对于其他类型较大。
图3 真菌群落在玫瑰酱中门(A)和属(B)水平上相对丰度基于99%的序列相似性Fig.3 Relative abundance of fungal communities of rose sauce at the phylum (A) and genus (B) levels based on 99% sequence similarity
从属水平可以看出，5种玫瑰酱中，最多的是酵母菌属，其次是葡萄菌属和间座壳属。虽然不同的样本中，真菌在属水平上存在一定的差异，但是不同样本属多样性存在的差异并不明显。研究人员采用高通量测序对豆瓣酱中微生物多样性进行研究，研究结果表明，豆瓣酱中结合菌门、担子菌门和子囊菌门是优势真菌门，而属水平上的曲霉属和酵母菌属是郫县豆瓣酱的优势属。与真菌多样性相比，玫瑰酱中的细菌多样性更加均匀，从5种玫瑰酱中，可以得出，不同的玫瑰酱中存在的真菌和细菌具有一定差异，此外，我们的研究结果表明，玫瑰酱中也包含一些分类地位尚不清晰的物种。
玫瑰酱的生产一般情况是在开放环境中进行的，在加工过程中不需要杀菌，所以玫瑰酱中微生物种类丰富。我国的玫瑰酱产地众多，但是玫瑰酱的生产没有统一的标准，导致不同的区域，甚至同一区域不同的生产时间，玫瑰酱的口感、风味和品质存在较大的差异[20]。另外，玫瑰酱中由微生物病原体造成的污染而引起的安全问题被社会广泛关注。
采用宏基因组的方法，对5种玫瑰酱中的微生物多样性进行研究和分析，研究结果表明，玫瑰酱中优势的细菌菌门包括变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，优势的细菌属包括假单胞属、泛菌属、罗森伯氏菌属、伯克氏菌属和劳尔氏菌属；
优势的真菌门包括担子菌门、子囊菌门，优势的真菌属包括酵母菌属，其次是葡萄菌属和间座壳属。