王雨嫣，董腾云 ，冯珊，王华芳
（1.长江大学附属第一医院，湖北 荆州434000；
2.武汉光谷中源协和细胞基因科技有限公司，湖北 武汉430206；
3.武汉光谷中源药业有限公司，湖北 武汉430206；
4.先策医药科技（武汉）有限公司，湖北 武汉430073；
5.华中科技大学同济医学院附属协和医院，湖北 武汉430022）
异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是治疗多种血液系统疾病的有效方法。单倍型造血干细胞移植（haploidentical hematopoietic stem cell transplantation，haplo-HSCT）的成功促进了我国造血干细胞移植病例数量的快速增长[1-3]。据中国造血干细胞移植登记组报告，2019年我国140家单位实施allo-HSCT近万例，其中haplo-HSCT占60%[4]。尽管allo-HSCT的疗效不断改善，移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）仍是主要的合并症和死亡原因[4]。
目前，有关急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）的病理、生理机制尚不明确。临床上治疗aGVHD首选方法仍是激素疗法，但易产生耐药性[5]。研究显示，对于激素耐药的GVHD患者，采用激素联合霉酚酸酯、抗肿瘤坏死因子抗体、人源化抗CD25等的治疗并没有延长病人的长期生存率[6-7]。因此，临床急需探索治疗激素耐药的aGVHD的方法，以期延长患者的生存期。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有多能间充质分化潜能的异质性基质细胞。体外和动物实验结果表明，MSCs具有免疫抑制、调节血管生成和修复内源性组织的特性[8-9]。临床试验已经验证了MSCs在自身免疫和炎症条件下的效用[10]。特别是在allo-HSCT中，已有多项研究证实，MSCs可治疗aGVHD和慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD），以及MSCs与造血干细胞共移植用以预防GVHD，可以增加造血干细胞移植的成功率[11]。为了更广泛地将MSCs应用于GVHD的临床治疗，现针对治疗GVHD的临床试验进展、MSCs的临床应用研究和作用机制予以综述。
GVHD是指异基因造血干细胞移植后，供者的T淋巴细胞受到受者抗原刺激后进攻受者靶细胞而出现的一系列不良反应[12]。美国国立卫生研究院（National Institute of Health，NIH）在临床上将GVHD分为aGVHD、cGVHD和重叠综合征3种。其中aGVHD根据供者淋巴细胞回输（donor lymphocyte infusion，DLI）的时间分为经典aGVHD和晚发aGVHD。经典aGVHD一般是指发生在移植后或DLI后100 d以内（包括第100天），主要表现为皮肤、胃肠道和肝脏3个器官的炎性反应，如典型皮疹、腹部绞痛、腹泻、胆红素升高[13]；
晚发aGVHD是指临床表现为aGVHD但发生在移植或DLI 100 d后，常与减停免疫抑制剂有关，包括以下几种情况：100 d后新发生的aGVHD、已获控制的经典aGVHD在100 d后再激活、经典aGVHD延续至100 d后。cGVHD发生在移植或DLI后的任何时间，其临床表现类似于自身免疫性疾病，具体表现为皮肤出现苔藓样变或硬皮样变、口腔黏膜干燥、眼部干燥、胆汁淤积等。重叠综合征是指同时存在aGVHD和cGVHD的临床表现，被视为cGVHD的重叠亚型[14-15]。
根据受累器官的累及程度，aGVHD分为4种类型：Ⅰ型（轻度）、Ⅱ型（中度）、Ⅲ型（重度）和Ⅳ型（重度）。研究显示，中度和重度aGVHD发生率为13% ～ 47%，发生率的差异主要与性别、年龄、移植类型、HLA不相合的位点数量以及aGVHD的预防方案不同有关：在同胞全相合移植中，Ⅱ～Ⅳ、Ⅲ/Ⅳ度aGVHD发生率分别为13% ～ 35%和5.0% ～ 7.7%；
在非血缘供者移植中，Ⅱ～Ⅳ、Ⅲ/Ⅳ度aGVHD发生率分别为12.5% ～ 47.0%和6.6%～ 13.5%；
在haplo-HSCT中Ⅱ～Ⅳ、Ⅲ/Ⅳ度aGVHD发生率分别为18.5% ～ 43.9%和7.9% ～ 13.8%；
在脐血移植中，Ⅱ～Ⅳ、Ⅲ/Ⅳ度aGVHD发生率分别为28.0% ～ 30.6% 和 15.0% ～ 19.4%；
在接受同胞全相合移植的再生障碍性贫血患者中，重度aGVHD发生率最低[4]。
截至2022年4月26日，在ClinicalTrials.gov网站上搜索到治疗GVHD的研究（未暂停、未终止、未撤销）有698个，研究数量较多的是北美洲、欧洲和东亚，分别是399、152和89个。用MSCs治疗GVHD的研究（未暂停、未终止、未撤销）有45个，其中，东亚14个、北美洲12个以及欧洲11个。
截至2022年4月26日，在中国临床试验注册中心搜索“移植物抗宿主病”，相关药物临床试验共23个（见表1），其中干细胞治疗GVHD研究共6个，有探索性研究、Ⅱ期、Ⅳ期研究。其他为抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）、芦可替尼、西罗莫司、粪菌移植等的研究。关于芦可替尼的研究大多是上市后的Ⅳ期研究。
表1 中国临床试验注册登记 GVHD 药物临床试验列表Table 1 The list of GVHD drug clinical trials in Chinese Clinical Trials Registry
截至2022年4月26日，国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）登记的获得临床试验默示许可的治疗GVHD的临床试验共19个（见表2）， 其中6个为干细胞治疗GVHD的临床试验。
表2 CDE登记的获得临床试验默示许可的治疗GVHD的临床试验Table 2 Clinical trials registered at CDE with implied approval for the treatment of GVHD
续表1
续表2
目前，标准皮质类固醇治疗GVHD的总有效率为50%，各种免疫抑制剂的完全缓解率（complete response，CR）约为30%。虽然aGVHD可以通过糖皮质激素和免疫抑制剂得到部分控制，但仍会出现严重的激素抵抗、继发感染和减弱的移植物抗肿瘤作用（graft-versus-leukemia，GVL），最终导致治疗不耐受或肿瘤复发[16]。因此，aGVHD的生物治疗创新研发具有巨大的吸引力。
截至2021年，全球已分别在加拿大和日本批准上市两款治疗GVHD的干细胞产品：Prochymal（又叫Remestemcel-L）和Temcell[17]。2009年12月，Prochymal以孤儿药的方式被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准治疗GVHD和克罗恩病。在Ⅲ期临床试验中，Prochymal在类固醇难治性急性移植物抗宿主病（steroid-refractory aGVHD，SR-aGVHD）儿童患者首次类固醇治疗失败后使用，取得了较好的治疗效果[18]。这显示了Prochymal作为一线治疗药物的安全性、耐受性和有效性。不过FDA拒绝了其首次申请，理由是临床试验数据来自单臂试验而不是随机试验，建议至少再做一次随机试验。2012年，Prochymal被出售给澳大利亚的Mesoblast公司，并在加拿大获得有条件上市批准，适应证为儿童类固醇难治性aGVHD。2012年6月，Prochymal在新西兰获批，但于2016年6月被通知批准失效。2015年，Mesoblast与JCR Pharmaceuticals Co., Ltd合作，将Prochymal改名为Temcell，并于2016年在日本上市。
在一项随机、多中心、Ⅱ期临床试验中，Remestemcel-L分别以每千克2×106和8×106个细胞的剂量与皮质类固醇联合治疗Ⅱ/Ⅳ级GVHD患者，其数据结果显示，Remestemcel-L低剂量和高剂量在安全性和有效性方面没有差异。Remestemcel-L在GVHD患者中有诱导较高比例的应答，94%的患者对Remestemcel-L有初步反应，77%的患者完全缓解，16%的患者部分缓解（partial remission，PR），并未见输注毒性和异位组织形成[19]。在Remestemcel-L治疗激素难治性aGVHD患者的Ⅲ期研究中，对260例患者输注每千克2×106个细胞，每周2次，连续4周，其中163例患者接受了至少1次Remestemcel-L输注，81例患者接受安慰剂和另一种二线治疗，发现接受至少1次Remestemcel-L输注的患者在第28 天实现总体缓解（overall remission，OR）的比例以及在第180天的生存率（overall survival，OS）与安慰剂组之间没有差异；
接受至少1次Remestemcel-L输注的肝脏受损患者比接受安慰剂组的患者有更高的持久完全缓解，但是没有达到更持久完全缓解的主要终点[18]。亦有单臂扩大治疗研究表明，在SR-aGVHD的患者中，Remestemcel-L治疗是有效的[20]。
Temcell是一种低温保存的人骨髓源性MSCs产品，于2016年在日本被批准用于治疗所有年龄段的GVHD患者。根据包装说明书，Temcell以每千克2×106个细胞的剂量静脉输注给aGVHD患者，每周2次，连续4周，间隔至少3 d输注；
此外，以每千克2×106个细胞的剂量额外输注Temcell，每周1次，连续4周；
但是MSCs治疗的实际细胞数量、输注频率和开始时间由医生决定[21]。一项Ⅰ/Ⅱ期研究显示，14例Ⅱ/Ⅲ级SR-aGVHD患者治疗4周后的总缓解率（overall response rate，ORR）为93%[22]，一项Ⅱ/Ⅲ期研究显示，25例Ⅲ/Ⅳ级SR-aGVHD患者24周后的持久缓解率为48%[23]。为了评估Temcell在现实环境中的疗效，有研究收集了该药批准后最初3年，即2016年2月—2018年12月，接受该治疗的所有连续输注患者的疗效结果，共有381例患者实现中性粒细胞移植并接受至少1次Temcell输注，这381例患者6个月时的总生存率为40%；
在MSCs治疗和具有MSCs治疗前后GVHD状态详细信息的309例患者中，对可评估的306例患者进行分析发现，MSCs治疗后第28天的ORR为56%；
309例患者中有151例患者接受经典aGVHD一线类固醇治疗后，使用Temcell作为二线治疗，发现其中61%的患者在第28天实现缓解；
在所有患者中，aGVHD的器官受累与较低的ORR有关；
在经典aGVHD的一线类固醇治疗后接受二线MSC治疗的患者中，aGVHD的器官受累情况和一线类固醇治疗到二线MSC治疗的持续时间（≥14 d）与较低的ORR有关；
标准化的MSCs产品Temcell为aGVHD患者提供了较好的OR；
在MSCs治疗aGVHD有所缓解的患者中0.5和1年时的平均 OS分别为 51%（95% CI，43% ～ 59%）和41%（95% CI，33% ～ 49%），而无OR患者的平均OS分别为16%（95% CI，11% ～ 23%）和9%（95%CI，5% ～ 15%）；
这项研究表明，在开发出一种有利于提高患者生存率的新疗法之前，Temcell是SR-aGVHD的治疗选择之一[21]。
目前，由于Temcell在现实环境中对GVHD患者的ORR与Remestemcel-L在严格合格标准的前瞻性研究中观察到的结果相当，因此两款产品被认为是等效的[17]。
骨髓MSCs通过抑制T和B淋巴细胞活化，阻断抗原呈递细胞功能，抑制自然杀伤细胞的活化，增加调节性T淋巴细胞数量，从而减轻炎症，诱导免疫耐受[24]。Le Blanc等[25]研究显示，MSCs治疗具有良好的反应和耐受性，并且没有与输液相关的毒性或异位组织形成。然而，骨髓MSCs的特征存在以下明显的异质性：组织来源、细胞培养条件、培养基补充、传代数以及新鲜或冷冻保存，这使得MSCs疗法在aGVHD治疗中的临床机制研究变得复杂[21]。
MSCs被用于治疗aGVHD，因为MSCs可通过释放免疫抑制分子、生长因子、趋化因子和外泌体等各种介质，从而产生强大的免疫抑制能力[16]。多项研究表明，MSCs通过抑制T细胞的增殖和活性，诱导调节性CD4+CD25+T细胞的增殖，促进免疫抑制骨髓细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）的浸润[26]，抑制树突状细胞等抗原提呈细胞的增殖和活化来减弱aGVHD[27-30]。目前已有研究表明，提高MSCs的免疫抑制活力，有利于MSCs抑制或减弱aGVHD。例如，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 高表达的小鼠MSCs在体外抑制淋巴细胞增殖的能力更强，在体内则减弱了aGVHD[31]。胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）高表达的MSCs（ICAM-1highMSCs）抑制了树突状细胞的成熟，降低了T细胞的免疫应答，延长了GVHD小鼠的存活期[32]。与健康捐赠者的血浆相比，GVHD患者的血浆处理过的MSCs具有更高的免疫抑制活性，这为进一步提高MSCs在GVHD的治疗开辟了新思路[33]。
来自MSC外泌体（MSCs-Exo）的微核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在调节免疫应答中发挥着关键作用[16]。为了研究miRNAs对aGVHD的免疫调节作用，对来自人脐带间充质干细胞（huc-MSCs）和鼠紧凑骨间充质干细胞（mb-MSCs）的外泌体miRNAs进行了表达谱分析，发现MSCsexo来源的MiR-223可以通过抑制小鼠淋巴内皮细胞ICAM-1的表达和抑制T细胞的黏附、迁移来减少供体T细胞对脾脏、肝脏和肠道的浸润，同时降低炎症因子干扰素 γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-17（(Interleukin-17，IL-17）的水平，从而减轻aGVHD的症状[34]。MSCs衍生的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）在aGVHD的治疗中也起到了一定效果。Fujii等[35]通过向aGVHD小鼠模型中输注EVs发现，EVs通过抑制T细胞从幼稚表型向效应表型分化和高表达miR-125a-3p，从而缓解GVHD靶向器官的病理损伤并延长aGVHD小鼠的生存时间。
此外，在一项随机临床研究中，将50例急性白血病患者随机分为外周血干细胞治疗前输注脐带来源的间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，U-MSC）组和不输注U-MSCs组，发现输注U-MSCs组血小板移植时间明显较快并且发生Ⅱ级或以上的aGVHD的比例明显降低；
但是预输注U-MSCs促进血小板植入的机制不明[36]。
GVHD的一线药物是激素药物，但是其治疗效果并不理想，特别是对于激素耐药的患者，该类患者预后较差[37]，并且2年总体生存率低于20%甚至更低[38]。MSCs缺乏人类白细胞抗原（HLA）Ⅱ类表达，这使得在没有供体-受体匹配的情况下可以进行异体给药，同时MSCs强大的免疫抑制能力使其在预防和治疗GVHD中发挥着重要作用[38]。
据统计，50%以上接受HSCT的患者发生了GVHD[39]。随着造血干细胞移植数量的增加，特别是非血缘供者移植数量的增多，GVHD患者的数量将大幅增加，这对患者生存造成了威胁[29]。
GVHD在预防和治疗方面都面临挑战。在预防性方面，移植后T细胞的活性抑制是最常用的预防策略。使用ATG和抗淋巴细胞球蛋白（antilymphocyte globulin，ALG）制剂测试了在体内使用抗T细胞抗体预防GVHD的效果发现，这两种药物降低了GVHD的发病率，但它们仍然不是提高长期生存率的最佳药物[40]。在治疗选择上，类固醇药物由于其强大的抗淋巴细胞和抗炎作用，仍然是治疗GVHD的一线标准治疗药物。然而，类固醇药物治疗也有明显的缺陷，在接受类固醇治疗的GVHD患者中，只有不到一半的患者获得完全缓解，更多患者出现类固醇难治性，OS仍较差[12]。尽管过去几年在HSCT领域取得了重要进展，但这几乎仍没有改善GVHD的发病率或病死率[41]。严重GVHD患者的长期存活率预期仍很低：Ⅲ级为25%（5年），Ⅳ级为5%[42]。随着异基因移植成为一种越来越有吸引力的临床治疗选择，对GVHD新治疗方法的探索也在持续加速。
MSCs联合二线治疗，如巴利昔单抗、CNI可提高治疗SR-aGVHD的疗效，降低二线药物和cGVHD的药物毒性而不增加GVHD的复发，且耐受性良好[43]。一项患有SR-GVHD的儿童和青少年的长期跟踪研究进一步确认了MSCs在治疗GVHD方面的安全有效性。这项研究包括了25例患者，其中10例在HSCT术后死亡，存活患者观察期中位值达到9.3年；
15例患者有所缓解，其中76%达到PR，24%达到OR，并且经过MSCs治疗后，还实现了改善肠道和肝脏功能的反应[44]。
另外在一项针对MSC治疗cGVHD的前瞻性、单臂、单中心Ⅱ期研究中，对11例重度、难治性cGVHD患者在6 ～ 12个月中反复注射异体B-MSCs，其中有6例患者对B-MSCs治疗符合美国NIH的反应标准，并伴随着GVHD相关症状和生活质量的改善；
该研究表明，对于严重SR-cGVHD患者，反复灌注MSCs是一种安全且有价值的治疗选择[45]。
对7项关于预防GVHD的随机对照试验和3个关于治疗GVHD的研究进行的系统分析显示，MSCs输注可以降低cGVHD的发生率，但不能降低aGVHD的发生率，MSCs输注可通过增加CR和延长生存期，从而对已经患有aGVHD的患者起到积极作用[29]。
来自随机对照实验（randomized controlled trial，RCT）和非随机对照实验（non-randomized controlled trial，NRCT）的证据表明，MSCs可以在HSCT中发挥包括促进移植（U-MSC）、预防GVHD（主要是cGVHD）和改善aGVHD的重要作用。MSCs输注仅在治疗而非预防GVHD的情况下可提高患者生存率。目前对于GVHD的预防，在HSCT后输注和使用U-MSC是抑制cGVHD发病率和增加移植成功率的最佳方法，并可能降低复发率和病死率。输注MSCs能使大部分难治性GVHD患者的病情得到缓解，并延长其生存时间，是一种安全有效治疗难治性GVHD的新型手段，但是目前仍需大量随机对照实验来对比不同治疗方案对难治性GVHD的疗效。在造血干细胞移植前输注和使用B-MSC可能对患者有害，因此需要认真考虑。由于纳入荟萃分析的研究和患者数量有限，因此，未来需要通过更多的高质量临床试验对大量患者进行验证，确定MSCs输注对治疗GVHD的临床影响。同时MSCs的来源、细胞培养条件、传代数、新鲜或冷冻保存以及输注剂量和频率均会影响MSCs治疗的稳定性。评价MSCs治疗的最佳选择方案仍有待深入，从而为MSCs的临床应用铺平道路。
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