祁 月，戴厚永
（1 南通大学附属医院肾内科，南通 226001；
2 江苏省省级机关医院肾内科）
糖尿病（diabetes mellitus,DM）是人类面临的一大健康难题，据统计，全世界每11 个成年人中就有1 个患有DM，每6 s 就有1 人死于DM 及其并发症[1]。糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）是DM 的重要并发症，在我国约21.3%的DM 患者并发DKD[2]。矿物质代谢紊乱是DKD 晚期常见的并发症，增加了患者心血管事件的发生率及死亡率[3-4]。
Klotho 有α、β 和γ 3 种类型，本研究仅针对αKlotho（简称Klotho）。Klotho 主要在远曲小管表达，循环中可溶性Klotho 蛋白在近端肾小管通过转胞作用由基底端向顶端分泌，随尿液排出体外[5]。此外，Klotho 在甲状旁腺、肠道、骨骼等也有表达[6-7]。研究[8]发现在慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）中，血清Klotho 的变化早于钙（divalent calcium ion,Ca2+）、磷（inorganic phosphate,Pi）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）等矿物质代谢的改变。在DKD中，有关血清Klotho 的变化报道不尽相同，C.WU等[9]发现DKD 患者血清Klotho 水平低于健康对照组，相反，A.INCI 等[10]发现DKD 患者血清Klotho 高于健康对照组。基于此，本研究检测非透析DKD 患者的血清Klotho、成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor-23,FGF-23）水平，探究其变化趋势，并分析其与钙磷代谢相关指标的关系，指导DKD 患者钙磷代谢紊乱的治疗。
1.1 研究对象 选取2020 年1—12 月于南通大学附属医院肾内科就诊的非透析DKD 患者65 例及同期体检正常人16 例作为研究对象。DKD 诊断标准参照《糖尿病肾病防治专家共识（2014 年版）》[11]。排除标准：（1）有活动性或慢性持续感染或炎症性疾病；
（2）肿瘤；
（3）原发甲状旁腺疾病或有甲状旁腺手术史；
（4）严重肝功能不全；
（5）妊娠。根据估计肾小球滤过率（estimate glomerular filtration rate,eGFR）对DKD患者进行亚组分析，将CKD 1～2 期定义为轻度损害组，3～4 期为中度损害组，5 期为重度损害组。本研究方案通过南通大学附属医院伦理委员会批准（2017-K020）。
1.2 观察指标 收集研究对象的基本信息：年龄、性别；
实验室指标：肌酐（creatinine,Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、eGFR、Ca2+、Pi、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c）、1,25 二羟维生素D3[1,25 dihydroxyvitamin D3,1,25-（OH）2D3]、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、PTH、24 h 尿蛋白定量。用ELISA 试剂盒测定血清Klotho 及FGF-23 的浓度（中国，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。
1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0 处理数据，正态分布资料用表示，非正态分布资料用中位数、四分位数间距[M（Q25,Q75）]表示；
两组间比较：正态分布资料采用独立样本t 检验，非正态分布资料采用Mann-Whitney U 检验；
多组间比较：正态分布资料采用单因素方差分析，非正态分布资料比较采用Kruskal-Wallis H 检验；
定性资料的比较采用χ2检验；
应用Spearman检验行相关分析，采用多元线性回归分析确定影响Klotho 的因素；
以P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 正常组及DKD 患者不同分期各指标的比较各组患者性别、年龄、HbA1c 比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。中度及重度损害组的血Ca2+、1,25-（OH）2D3低于正常组；
中度及重度损害组的PTH 高于正常组；
重度损害组的血Pi 高于正常组（表1）。血清Klotho 在轻度损害组较正常组升高，在中度损害组下降并低于正常组（图1A）。与正常组相比，FGF-23在轻度损害组就升高，此后，随着CKD 的进展一直处于高水平（图1B）。
图1 正常组及DKD 患者不同分期血清Klotho 及FGF-23的变化趋势
表1 正常组及DKD 患者不同分期各指标的比较[n,,M（Q25,Q75）]
表1 正常组及DKD 患者不同分期各指标的比较[n,,M（Q25,Q75）]
注：与正常组比较，#P<0.05；
组间两两比较，*P<0.05。
2.2 血清Klotho 与各指标之间的相关分析
2.2.1 血清Klotho 与各指标之间的简单相关分析Spearman 相关分析显示血清Klotho 与FGF-23、Ca2+、eGFR、Hb 呈正相关，与Cr、24 h 尿蛋白呈负相关（表2）。
表2 血清Klotho 与各指标之间的简单相关分析
2.2.2 血清Klotho 与各指标的多元线性回归分析以Klotho 为因变量，以年龄、FGF-23、Ca2+、Pi、1,25-（OH）2D3、PTH、Cr、eGFR、24 h 尿蛋白为自变量进行回归分析。模型3（r=0.811）结果显示：FGF-23、24 h 尿蛋白、Cr 与Klotho 呈线性相关，其中FGF-23与Klotho 呈正相关，24 h 尿蛋白、Cr 与Klotho 呈负相关，根据标准化系数，影响程度：FGF-23＞Cr＞24 h尿蛋白。建立线性回归方程为：Y（Klotho）=697.98+7.277×FGF-23-0.745×Cr-22.376×24 h 尿蛋白（表3）。
表3 线性回归逐步法
钙磷代谢紊乱可引起血管钙化、肾性骨病等不良后果。Klotho 是调节钙磷代谢的重要因子，作用于肾小管、肠道、甲状旁腺发挥降磷、促进钙吸收、抑制PTH分泌的作用[12-14]。本研究发现，非透析DKD 患者随着疾病的进展其血清Klotho 较正常人先升高然后下降，且其变化早于钙磷代谢紊乱的发生，提示Klotho 可以作为预测DKD 矿物质代谢紊乱的早期生物学指标。
本研究中，轻度损害组血清Klotho 水平高于正常组，钙磷维持在正常范围；
在肾功能中、重度损害组血清Klotho 低于正常，其对磷酸钠协同转运蛋白2a及2b 的作用减弱，FGF-23-成纤维细胞生长因子受体1c-Klotho 复合物减少，血Pi 升高，血Ca2+降低[13-14]。此外，Klotho 表达的下调，异常升高的FGF-23 已无法有效地抑制PTH 的合成，以致甲状旁腺对FGF-23 产生抵抗，PTH 上升[15]。
与本研究相同，仅纳入肾功能失代偿期DKD 患者的研究[16]中血浆Klotho 低于正常，而在肾功能尚存的DKD 患者中血浆Klotho 水平较高[17]，进一步支持了Klotho 可作为预测DKD 矿物质代谢紊乱的早期生物学指标。Klotho 在CKD 晚期下降，普遍认为是由肾小管萎缩[18]、低浓度的1,25-（OH）2D3，高磷酸盐水平、炎症细胞因子TNF-α／γ 的增加及尿毒症毒素硫酸吲哚诱导的Klotho 启动子去乙酰化、过甲基化等共同促进的[19-20]。本研究发现24 h 尿蛋白与血清Klotho 呈负相关，提示蛋白尿是血清Klotho 下降的促进因素。白蛋白尿是DKD 患者的常见临床表现，在体外实验中证实了白蛋白可以降低肾小管细胞清Klotho 的水平，进一步支持了本研究结论[21]。但DKD 早期血清Klotho 尚不降低的原因还不清楚，可能与FGF-23 以及胰岛素的使用相关。C.D.CHEN等[22]在体外实验中证实了胰岛素可以增强Klotho 脱落形成130 ku 的蛋白，并且胰岛素引起的Klotho 脱落较对照组增加2～3 倍。本研究中轻度损害组胰岛素使用率稍高，这可能引起了轻度损害组血清Klotho 的升高，但有关胰岛素在人体使用对血清Klotho 的增加效果仍需更多实验证实。此外，FGF-23的升高或许也是早期DKD 患者血清Klotho 升高的原因，本研究得出FGF-23 与Klotho 呈正相关。B.RICHTER 等[23]在体外实验中证实了FGF-23 的异常升高能增加解整合素金属蛋白酶17 的表达从而增加Klotho 水平。FGF-23 在CKD 早期就升高，刺激了血清Klotho 的升高，疾病后期膜Klotho 减少，即使FGF-23 再高也难以增加血清Klotho，加之上述负性调节因素，血清Klotho 下降。此外，血清Klotho经尿液排出体外，有研究[24]表明尿Klotho 随着疾病的进展而下降，至CKD 4、5 期较CKD 1 期明显下降，提示尿Klotho 排泄的减少或许也是血清Klotho升高的原因。但本研究并未对尿Klotho 进行测定，故关于DKD 患者尿Klotho 的排泄是否降低仍需后续实验进一步明确。
综上所述，DKD 非透析患者血清Klotho 随着疾病进展先升高后逐渐下降并低于正常。这种变化早于血Pi 的增高、血Ca2+及1,25-（OH）2D3降低的发生，提示血清Klotho 可能成为预测DKD 矿物质代谢紊乱的早期生物学指标。但是，目前市售测定可溶性Klotho 的性能和可重复性方面仍存在问题，样品类型、质量、收集和处理方法、使用年限和储存条件以及冻融循环次数的差异都会影响测定结果，仍需对Klotho 的测定方法进行优化[25]。
本研究也存在一些局限性：（1）DKD 的诊断为临床诊断，未行肾穿刺，可能合并其他肾脏疾病，并不能完全反应DKD 真实的血清Klotho 水平。（2）本研究为单中心、横断面研究，纳入的研究对象相对较少，还需要行多中心、大样本的临床研究加以验证。
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