班雪花，黄宝学*，刘春西 ， 覃凤娇
(1.田东县动物疫病预防控制中心，广西 田东531500；
2.田东县祥周镇水产畜牧兽医站；
3.田东县林逢镇水产畜牧兽医站)
疫病的流行是制约生猪产业持续健康发展的主要因素之一，尤其是传染性强的病毒性疫病，对养猪业危害日趋严重。相关研究结果表明，猪瘟(CSF)、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征(HP-PRRS)、猪伪狂犬病(PR)和猪圆环病毒2型(PCV-2)是危害当前养猪业的四种重要的病毒性疫病，这些病原常以单独或混合感染的方式感染猪，引起猪体温升高、腹泻、繁殖障碍、呼吸困难等症状，造成猪群生长缓慢或停滞、病残和死亡猪只数量增多，饲料报酬降低、生长速度和猪群整体均匀度降低，给养猪业造成了严重的经济损失，甚至危害到公共卫生安全。因此，在养猪生产中对这四种疫病的防控尤为重要。
随着养殖户防控意识的提高，很多养猪场对以上四种疫病采取了疫苗免疫、结合净化和生物安全措施进行防控，但由于饲养管理不当、防疫操作不规范、标准化养殖滞后、不注重饲养环境等各方面原因，上述疫病仍在猪群发生和流行。为掌握2021年广西田东县不同养殖阶段猪群CSFV、HP-PRRSV、PCV-2和 PRV感染情况及整体免疫抗体水平，笔者利用 PCR、RT-PCR与ELISA方法开展监测，以便为这些疫病的防控提供科学依据。
1.1 采样方案与样品来源
田东县有10个乡镇，每个乡镇选定2个养殖量300头以上的猪场为调查监测对象，全县共选定20个猪场为调查监测对象，2021年1～12月按采样计划采集样品，并做好样品信息记录，置于-20℃冰箱保存待检。
1.1.1 组织样品 调查监测期间，对监测对象的20个场发现有疑似猪瘟高致病性猪繁殖与呼吸综合征(猪蓝耳病)、猪圆环病毒 2 型和猪伪狂犬病这四种疫病临床症状的死淘猪，由田东县动物疫病预防控制中心负责采集组织样品，每份组织样品包含脾脏、肺脏、扁桃体各约10 g、腹股沟浅淋巴结2个，用 10毫升螺旋管存放冰冻保存，并当场收集样品信息，记录死淘猪的死亡时间、年龄段、免疫情况、临床症状、病理特征等相关信息，存档以便检测后进行分析，期间采集到母猪31份、育肥猪52份、保育猪79份共162份组织样品，送至百色市动物疫病预防控制中心实验室进行CSFV、HP-PRRSV、PCV2和 PRV检测。
1.1.2 血清样品 各个猪场均按本场免疫程序开展免疫，每个猪场在常规免疫21天后采集种母猪5份、育肥猪10份、保育猪5份，共20份血样。采集当天做好样品信息记录，记录内容包含动物年龄、免疫疫苗种类、厂家、批号、免疫日期等信息，存档以便检测后进行分析，期间采集到母猪100份、育肥猪200份、保育猪100份共400份血样。血样由田东县动物疫病预防控制中心实验室分离，每份血清不少于1.5 mL，-20℃保存待检。根据采集的免疫血清信息了解到，所有猪场均免疫了CSF弱毒疫苗和HP-PRRS灭活苗，PR活疫苗和PCV2灭活疫苗免疫只有少数猪场开展，因此不检测PR-gB和PCV2免疫抗体，PRV-gE-ELISA检测目的是了解野毒感染情况。此次检测对采集到的400份血清样品进行CSFV、PRRSV及PRV-gE抗体检测。
1.2 主要试剂与检测仪器
猪瘟抗体ELISA检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试剂盒购自哈尔滨元亨生物药业有限公司。PRV-gE 抗体检测试剂购自深圳真瑞生物科技有限公司、猪瘟病毒 RT-PCR 检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594-1680变异株)RT-PCR试剂盒、 伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒、猪圆环病毒PCR检测试剂盒，均购自深圳澳东检验检测科技有限公司。病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒，为西安天隆科技有限公司产品。组织研磨仪、天隆核酸提取仪、罗氏荧光RT-PCR仪、Biometra PCR仪、酶标仪等。
1.3 方法
1.3.1 病原学检测 ①病毒DNA/RNA提取，研磨处理病料，根DNA/RNA快速抽提试剂盒说明书进行DNA/RNA提取，对所获得的DNA/RNA直接进行PCR/RT-PCR检测或-20℃保存备用。② CSFV、HP-PRRSV的RT-PCR检测，对提取的样品RNA进行 RT-PCR扩增。RT-PCR扩增体系25μL：样品RNA 5 μL，核酸扩增反应液16μL，待检病毒反应液2μL，RT-PCR酶混液2 μL。RT-PCR扩增反应条件：50℃反转录30min；
95℃预变性5 min；
95℃变性10s，55℃延伸40s，共45个循环。判定标准：反应结束后读取Ct值及结合扩增曲线显示判定，Ct值≤37.0，且出现明显的指数增长期，判为病原核酸阳性。无Ct值或Ct值>37.0判为阴性。③PCV2和PRV的PCR检测，对提取的样品DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系同 ②。PCR扩增反应条件:95℃预变性3 min；
95℃变性5s；
55℃退火/延伸40s，共 45 个循环。判定标准：反应结束后取读取Ct值及结合扩增曲线显示判定，Ct值≤37.0，且出现明显的指数增长期，判为病原核酸阳性。无Ct值或Ct值>37.0判为阴性。
1.3.2 血清抗体检测 CSFV、HP-PRRSV及PRV-gE抗体检测按照相应的检测试剂盒说明书开展检测，CSFV抗体检测结果OD450值>阳性对照OD450值×0.3判定为阳性；
HP-PRRSV抗体检测结果OD650值>阳性对照OD650值×0.3判定为阳性；
PRV-gE抗体检测结果样本OD450平均值/ 阴性对照OD450平均值≤ 0.6判定为阳性。否则判定为阴性。
1.4 数据分析方法
根据实验检测结果，结合采集的组织样品和血清样品记录信息，采用SPSS statistics 17.0，对检测结果数据进行统计学分析处理。
2.1.1 病原学检测结果分析 ① 四种病原检测猪年龄段感染结果，从表1可知：样品检出率最高的是PCV2， 阳性率为 40.74%，同比其他检测病种阳性率差异显著；
HP-PRRSV次之，阳性率为 6.79%；
再次为PRV ，阳性率为 1.85%；
162份组织样品中未检出CSFV病原。② 四种病原检测猪季节感染结果，从表2可知：检测的162份组织样品中，HP-PRRSV在第2-3季度病原检出率相对第1、4季度高；
PRV在第1、4季度检出病原，第2～3季度未发现病原；
PCV2感染发病没有明显的季节性，一年四季均可发生。从统计来看，按季节统计四个病种合计检测阳性率没有明显差异。
表1 四种病原检测猪年龄段感染情况
表2 四种病原检测猪季节感染情况
2.2 血清学检测结果分析
由表3可知：CSFV、HP-PRRSV抗体阳性率均达到了国家规定70%以上的要求。CSFV保育猪抗体水平与种母猪群、育肥猪群存在差异显著。各养殖阶段猪群PRV-gE均检出抗体，种母猪的抗体阳性率最高,为23%，显著高于育肥猪和保育猪。表明猪群感染PRV野毒较严重。
表3 不同阶段猪群CSFV、HP-PRRV、PRV-gE抗体检测结果
近年来，受非洲猪瘟疫情的影响，各猪场加强生物安全管理，为降低风险而采取的综合措施，对阻断疫病的传播与流行起到了重要作用。但是，本研究结果表明，HP-PRRS、PCV2 和PR三种病原还存在不同程度的风险隐患，CSF病原虽然在本次检测未发现，不代表它不存在，这四种疫病对猪群仍有不同程度的威胁，一但感染其中一种病毒都会对猪体产生免疫抑制和繁殖障碍，生产上一定要采取综合防控措施。各猪场应根据本场的疫病流行情况，根据季节气候变化情况，采取免疫、监测、净化等综合防控措施，切实做好CSF、HP-PRRSV、PRV、PCV2等四种疫病的防控。
3.1 巩固当前CSF的有效防控
本次CSFV检测结果显示：猪群CSFV抗体总阳性率为87%，超过了国家规定70%以上，表明田东县猪场对猪瘟疫苗免疫较为重视，免疫效果较为理想。但不同种类别猪群之间的抗体阳性率存在差异，保育猪的抗体阳性率明显低于种母猪与育肥猪，这与韦显凯等的研究一致。疫苗免疫能够降低疫病循环中的病原体数量，降低感染猪群的发病率和死亡率，能够保护动物免于临床发病，能够使免疫猪群抗体阳性和抗原阳性呈反相关。本次检测未能检测到CSFV病原阳性，说明疫苗免疫取得了明显成效，对控制疫病的发生与流行有一定的效果。但鉴于采集到的病料数量不多、覆盖面不广等因素影响，不排除猪瘟病原的存在。养猪生产中，应定期对不同养殖阶段猪群进行疫苗免疫跟踪监测，尤其是对保育猪群进行检测，评估监测结果，利用监测数据对免疫程序进行调整优化，确保猪群在安全免疫范围内。
3.2 制定免疫计划
本次HP-PRRSV检测结果显示：HP-PRRSV抗体总阳性率为77.5%，抗原总阳性率为 6.79%，说明HP-PRRSV在猪群中有一定的流行率。调查发现，对照检测中的HP-PRRSV阳性样品信息，均免疫过HP-PRRS弱毒疫苗，但却不能完全阻止HP-PRRSV感染。虽然，防止疫病的发生要采取提高饲养管理水平、严格的生物安全等综合防控措施，但疫苗免疫仍是防控该病的最有效措施。免疫猪群还发生HP-PRRSV感染，是因为抗体效价达不到抵抗HP-PRRS野毒的要求。弱毒疫苗免疫效果与猪群中的流行毒株密切相关，其对同一基因型同源毒株(homologousisolate)提供几乎完全保护，对异源毒株(heterologous isolate)提供部分保护，而对不同基因型毒株几乎不提供保护。PRRSV极易变异，在疫病流行的同时，病毒基因组不断发生变异，HP-PRRSV依然是广西的优势流行毒株。养猪生产中，猪场应重视选择疫苗毒株与临床流行毒株相匹配，要定期采集病料送实验室检测PRRSV毒株的类型，确定与哪种疫苗毒株的同源性和亲缘关系最接近，才能使用该种疫苗毒株进行免疫，实施针对性的免疫接种计划。
3.3 做好PCV-2定期监测
加强免疫接种，采取综合防控措施。本研究发现，PCV2感染最为严重，是造成猪场猪死亡的主要病原，病原总阳性率达40.74%，高于黎军199等2015—2019 年对广西部分猪场病死猪5种病毒的抗原检测，PCV2不同年度检出率的范围16.35%～36.11%，高于陈忠伟等2016—2019年对广西玉林市部分猪场主要病毒性疫病监测，对病死猪组织样品PCV2不同年度检出率范围14.8%～20.88%。说明田东县PCV2流行严重。分析可能是多数猪场不免疫PCV2疫苗、PCV2传播能力强、传播途径广泛，多为隐性感染，猪场不开展病原监测淘汰阳性猪导致病原在猪场循环传播、对患病猪没有采取隔离治疗、引种不规范、防疫混乱等因素有关。进一步研究发现，有5份样品为PCV2与其他病混合感染，混合感染率为3.08%。韦显凯等检测了152份采自广西地区的猪组织样品，发现PCV2与其他病混合感染率为17.76%。同珂等检测了152份采自华中部分地区发病猪群血清样品， 发现PCV2与其他病混合感染率为66.39%。上述研究表明，猪群中的PCV2与其他病混合感染较为普遍，需引起重视。生产过程中，猪场应加强疫苗的免疫接种，定期开展血清学与病原学监测，制定科学合理的综合防控措施，减少PCV2发生流行。
3.4 做好种猪群PR净化工作
本研究发表现，不同养殖阶段猪群中种母猪的PR野毒抗体阳性率最高，为 23%，病原检测样品中PRV在种母猪群检出率也为最高，阳性率为6.45%。表明种母猪感染及带毒现象严重。猪场中，母猪饲养时间较长，一旦感染PR野毒，可长期带毒排毒，引起持续性感染，种猪群净化是防控PRV的关键。目前，田东县生猪养殖规模仍以中小型养殖为主，建议猪场有计划对种猪群实行PR的净化工作，采取免疫控制，制定合理的免疫程序，定期进行抗体检测，适时淘汰阳性种猪，不断净化种猪群，使猪群gE抗体呈阴性状态，促进猪场的健康发展。
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