杨少君，周乃珍，王晓霞
（1.厦门大学附属中山医院心内科，福建厦门 361004；
2.厦门大学附属中山医院保健病房，福建厦门 361004）
心肌梗死等缺血性心脏病是导致心脏功能障碍的重要原因之一，活性氧自由基生产量增多可加重心肌细胞损伤，氧化应激反应可破坏心血管结构及功能，还可引起心肌细胞凋亡进而加重心肌细胞损伤，因而抑制氧化应激反应可降低心肌梗死等缺血性心脏病的发生率［1-2］。过氧化氢（H2O2）可促进心肌细胞凋亡从而诱导心肌细胞氧化损伤，并可用于建立体外心肌损伤模型［3］。环状RNA（circular RNA，circRNA）是由共价键结合形成的闭合环状RNA 分子，其不易被核酸外切酶降解且稳定存在于真核生物中，并可充当微小RNA（micro RNA，miR）的海绵分子而发挥功能作用，研究表明，circRNA在心肌细胞损伤中表达异常，并可能参与心血管疾病发生及发展过程［4］。circ_0000285在高糖诱导的足细胞损伤中表达上调，下调其表达可抑制氧化应激而减轻高糖诱导的足细胞损伤［5］。但circ_0000285 在H2O2诱导的心肌细胞中的表达及其可能作用机制尚未可知。通过靶基因预测显示circ_0000285 与miR-625 存在结合位点，研究表明，miR-625在帕金森病细胞模型中表达下调，上调其表达可抑制神经细胞凋亡从而减轻神经细胞损伤［6］。但miR-625在心肌细胞损伤中的表达及其可能作用机制尚未可知。因此，本研究主要探讨circ_0000285 是否可通过靶向调控miR-625 的表达从而参与H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤过程。
1.1 材料与试剂
H2O2购自美国Sigma；
大鼠心肌细胞H9C2 购自北京协和细胞资源中心；
丙二醛（malondialed⁃hyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
噻唑兰（Methylthiazolyldiphe⁃nyl-tetrazolium bromide，MTT）试剂、凋亡检测试剂盒、胰蛋白酶购自北京索莱宝；
DMEM 培养基、胎牛血清购自美国Hyclone；
兔抗鼠活化半胱氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，cleaved caspase-3）、微管相关蛋白轻链3（microtubule-asso⁃ciated protein 1 light chain 3，LC3）-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗体与二抗购自美国Abcam；
细胞裂解液、BCA 检测试剂盒购自北京康为世纪生物；
反转录试剂与SYBR Primix Ex Taq检测试剂购自美国Thermo Fisher；
Lipo⁃fectamine2000 购自美国Invitrogen；
Trizol 试剂购自北京全式金生物；
circ_0000285小分子干扰RNA（sicirc_0000285）及其阴性对照（si-NC）、miR-625寡核苷酸模拟物（miR-625 mimics）及阴性对照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-625 特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-625）及其阴性对照（anti-miR-NC）购自广州锐博生物；
circ_0000285 过表达载体（pcDNAcirc_0000285）及其空载体（pcDNA）购自上海吉满生物。
1.2 方 法
1.2.1 构建心肌细胞氧化损伤模型 参考文献［7］的方法，取对数生长期H9C2 细胞接种于96 孔板（3×103个/孔），加入含有200 μmol/L H2O2培养基处理48 h，记为H2O2组。同时将正常培养的H9C2 细胞记为Con 组。
1.2.2 实验分组 根据Lipofectamine2000 试剂盒说明书操作，采用脂质体转染法将si-NC、si-cic_0000285、si-circ_0000285 与anti-miR-NC、si-circ_0000285 与anti-miR-625 分别转染至H9C2 细胞，转染成功后加入含有200 μmol/L H2O2培养基处理48 h，分别记为H2O2+si-NC 组、H2O2+si-circ_0000285 组、H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC组、H2O2+si-circ_000028 5+anti-miR-625 组。
1.2.3 细胞中circ_0000285、miR-625 的表达水平检测 采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）进行检测，用Trizol 试剂提取各组H9C2 细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书将总RNA 合成cDNA，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 补足体系至20 μL；
反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 次循环。circ_0000285 以GAP⁃DH为内参，miR-625以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算circ_0000285、miR-625 相对表达量。circ_0000285正向引物5"-TACCTCTGCAGGCAGGAACT-3"，反向引物5"-TCACATGAATTTAGGTGGGACTT-3"；
GAPDH 正向引物5"-GCCATCACAGCAACACAG⁃AA-3"，反向引物5"-GCCATACCAGTAAGCTTGC⁃C-3"；
miR-625 正向引物5"-GGCTAGTTCACTCCT⁃CTCCTCG-3"，反向引物5"-GTGCAGGGTCCAGGT-3"；
U6 正向引物5"-CTCGCTTCGGC⁃AGCACA-3"，反向引物5"-AACGCTTCACGAATT⁃TGCGT-3"。
1.2.4 氧化应激指标MDA、NO 的浓度与SOD 的活性检测 将各组H9C2 细胞裂解后按照试剂盒说明书检测MDA、NO 的浓度与SOD 的活性，严格按照试剂盒说明书操作。
1.2.5 细胞增殖检测 各组H9C2 细胞（2×104个/mL）接种于96 孔板（100 μL/孔），于培养箱内培养24 h 后每孔加入MTT 溶液20 μL，于培养箱内继续培养4 h，1 300 r/min转速离心5 min后弃上清，每孔加入150 μL DMSO，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔光密度值（OD）并计算细胞存活率［实验组OD 值/对照组OD 值×100%］。
1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组H9C2 细胞后加入预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞后弃上清，收集细胞沉淀后加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC后室温避光孵育5 min，加入5 μL PI 后室温避光孵育10 min，应用FACS Calibur 流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.7 双荧光素酶报告基因检测circ_0000285 与miR-625 的靶向关系 Circ RNA Interactome 预测显示circ_0000285 与miR-625 存在结合位点，利用基因突变技术将结合位点进行突变，结合位点与突变位点的片段分别克隆至pmirGLO 载体得到野生型载体WT-circ_0000285、突变型载体MUTcirc_0000285，用脂质体转染法将miR-NC、miR-625 mimics 分 别 与WT-circ_0000285、MUT-circ_0000285共转染至H9C2细胞，于培养箱内培养24 h后收集细胞，并检测细胞荧光素酶活性。用脂质体转染法分别将pcDNA、pcDNA-circ_0000285、si-NC、si-circ_0000285 转染至H9C2 细胞后，采用qRT-PCR 法检测miR-625 的表达量。
1.2.8 Western blot 检测 Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ组H9C2 细胞裂解后提取细胞总蛋白，采用BCA 法检测蛋白浓度后加入5×SDS 上样缓冲液，于100℃水浴10 min，每孔上样量40 μg 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），275 mA 恒流下转膜90 min，5%脱脂奶粉封闭聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜2 h，Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 000）一抗与内参GAPDH抗体（1∶3 000）稀释液分别孵育PVDF 膜，4℃孵育过夜，TBST 洗膜，二抗稀释液（1∶5 000）孵育PVDF 膜1 h（37℃），滴加ECL 显影，应用Image J 软件分析各条带灰度值并计算LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ条带灰度值的比值。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，符合正态分布计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 H2O2诱导的心肌细胞中circ_0000285 与miR-625 的表达量比较
与Con 组比较，H2O2组circ_0000285 的表达量升高（P＜0.05），miR-625 的表达量降低（P＜0.05），见表1。
表1 H2O2诱导的心肌细胞中circ_0000285 与miR-625 的表达量比较 ［±s，n=9］
表1 H2O2诱导的心肌细胞中circ_0000285 与miR-625 的表达量比较 ［±s，n=9］
注：与Con 组比较，*P＜0.05
2.2 干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激的影响
与Con 组比较，H2O2组MDA、NO 的浓度升高（P＜0.05），SOD 的活性降低（P＜0.05）；
与H2O2+si-NC 组比较，H2O2+si-circ_0000285 组MDA、NO 的浓度降低（P＜0.05），SOD的活性升高（P＜0.05），见表2。
表2 干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激的影响 ［±s，n=9］
表2 干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激的影响 ［±s，n=9］
注：与Con 组比较，*P＜0.05；
与H2O2+si-NC 组比较，1）*P＜0.05
2.3 干扰circ_0000285 表达对H2O2 诱导的心肌细胞活力、凋亡及自噬的影响
与Con 组比较，H2O2组细胞存活率降低（P＜0.05），细胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白浓度升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05）；
与H2O2+si-NC 组 比 较，H2O2+si-circ_0000285 组细胞存活率升高（P＜0.05），细胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白浓度降低（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（P＜0.05），见图1、表3。
表3 干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞活力、凋亡及自噬的影响 ［±s，n=9］
表3 干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞活力、凋亡及自噬的影响 ［±s，n=9］
注：与Con 组比较，*P＜0.05；
与H2O2+si-NC 组比较，1）*P＜0.05
图1 干扰circ_0000285 表达后流式细胞术检测细胞凋亡率以及Western blot 法检测Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量比较
2.4 circ_0000285与miR-625靶向调控作用的验证
Circ RNA Interactome 预测显示circ_0000285 与miR-625 存在结合位点（图2A）。共转染野生型载体WT-circ_0000285 的细胞实验中，与miR-NC 组比较，miR-625 组荧光素酶活性降低（P＜0.05）（见图2B）。转染pcDNA-circ_0000285可抑制miR-625表达，转染si-circ_0000285 可促进miR-625 表达（图2C）。
图2 circ_0000285 与miR-625 靶向调控作用的验证（A：Circ RNA Interactome 预测显示circ_0000285 与miR-625 存在结合位点；
B：双荧光素酶报告实验；
C：qRT-PCR 法检测miR-625 的表达量）
2.5 抑制miR-625 表达可逆转干扰circ_0000285表达对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激、细胞活力、凋亡及自噬的作用
与H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC 组比较，H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-625 组MDA、NO 浓度升高（P＜0.05），SOD 的活性降低（P＜0.05），细胞存活率降低（P＜0.05），细胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白浓度升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05）（图3、表4）。
表4 抑制miR-625 表达可逆转干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激、细胞活力、凋亡及自噬的作用 ［±s，n=9］
表4 抑制miR-625 表达可逆转干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激、细胞活力、凋亡及自噬的作用 ［±s，n=9］
注：与H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC 组比较，*P＜0.05
图3 抑制miR-625 表达后流式细胞术检测细胞凋亡率以及Western blot 法检测cleaved caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达量比较
CircRNA 可参与心脏肥大、心肌梗死等多种心血管疾病发生及发展过程，研究表明，circRNA可能作为心血管疾病诊断及治疗的潜在靶点如，circ-HIPK2 通 过调 节miR-485-5p/ATG101 的 表 达而促进心肌细胞凋亡和自噬［8］。circRNA ncx1 通过靶向miR-133a-3p 介导缺血性心肌损伤［9］。circRNA_101237 通过靶向let-7a-5p/IGF2BP3 介导心肌细胞损伤［10］。circRNA Hipk3、circMACF1 等均可参与心肌细胞损伤过程，并可能作为心血管疾病治疗的潜在靶标［11-12］。
circ_0000285通过诱导Wnt/β-catenin信号传导途径在喉癌中发挥癌基因的作用［13］。circ_0000285通过调节miR-409-3p/IGFBP3 表达从而促进骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭［14］。但circ_0000285在H2O2诱导的心肌细胞中的表达尚未可知。本研究结果显示，H2O2诱导的心肌细胞中MDA、NO 浓度升高，SOD 的活性降低，与既往研究报道结果相似［15］，提示成功建立心肌细胞氧化损伤模型。本研究发现，H2O2诱导的心肌细胞中circ_0000285 的表达量升高，干扰circ_0000285 表达后MDA、NO 浓度降低，SOD 的活性升高，提示干扰circ_0000285 表达可抑制H2O2诱导的心肌细胞氧化应激反应。LC3属于自噬相关基因8 的同源物，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬体数量与自噬水平高低，caspase-3是调控细胞凋亡的关键蛋白酶，caspase-3 被激活后可促进细胞凋亡，抑制其表达可抑制细胞凋亡［16-17］。本研究结果显示，H2O2诱导的心肌细胞存活率降低，细胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白浓度升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，而干扰circ_0000285 表达后细胞存活率升高，细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 蛋白浓度降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，提示干扰circ_0000285 表达可促进H2O2诱导的心肌细胞增殖而抑制心肌细胞凋亡及自噬。
本研究通过双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验证实circ_0000285 可靶向结合miR-625，并可负向调控miR-625 的表达。研究表明，miR-625-5p 通过靶向AKT2 抑制人支气管上皮细胞炎症反应［18］。MiR-625-5p 通过靶向STAT3 和CaMKII 抑制心脏肥大［19］。本研究结果显示，H2O2诱导的心肌细胞中miR-625 的表达量降低，抑制其表达可逆转干扰circ_0000285 表达对H2O2诱导的心肌细胞增殖、氧化应激、凋亡及自噬的作用，提示circ_0000285 可通过靶向调控miR-625 而抑制H2O2诱导的心肌细胞增殖及抑制细胞氧化应激、凋亡及自噬。
综上所述，H2O2诱导的心肌细胞中circ_0000285的表达量升高，而miR-625 的表达量降低，干扰circ_0000285 表达可通过上调miR-625 的表达而促进H2O2诱导的心肌细胞增殖并可抑制心肌细胞氧化应激反应、凋亡及自噬，circ_0000285/miR-625 在缺血性心脏病发生、发展过程中可发挥重要调控作用，并可能作为缺血性心脏病诊断及治疗的潜在靶点。但关于其具体作用机制仍需进一步探究。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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