钟秋梅张佳李林英郑世进*
(1. 厦门大学生命科学学院,福建 厦门 361100;2. 厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室,福建 厦门 361100)
免疫记忆指当机体初次刺激时能产生一个免疫反应,当再次遇到同种刺激时机体能产生更强大的免疫反应。1950 ~ 1960年,免疫学家一直认为只有具有T/B淋巴细胞的脊椎动物才具有免疫记忆[1]。后天免疫反应依赖于T/B淋巴细胞,特异性识别病原体并建立该特定感染的免疫记忆。在第2次遇到相同的病原体时,记忆T/B细胞的克隆扩增会诱导快速有效的反应。然而,在后面的研究当中发现在一些植物或非脊椎动物,甚至一些细菌和古细菌中也有免疫记忆,但显然它们的免疫记忆并不是由T/B淋巴细胞介导的[1]。研究报道,缺乏T/B细胞的Rag1-/-小鼠初次感染过非致死剂量的白色念珠菌(Candidaalbicans),当再次感染时能够抵抗感染而存活下来[2]。这说明先天免疫系统也能介导一种免疫记忆的产生,后来免疫学家将这种先天免疫介导的保护作用定义为训练免疫(trained immunity)[3]。训练免疫是指先天免疫系统在首次遇到刺激后,经过急性反应回到稳态后,当再次遇到同源或异源刺激时,机体能产生更快速的免疫应答,从而保护机体。β-葡聚糖(β-glucan)是训练免疫的典型诱导剂,β-glucan训练免疫模型最开始在人源单核细胞中建立。先天免疫细胞如单核细胞和巨噬细胞,当第1次遇到β-glucan时,细胞内糖代谢途径向有氧糖酵解转变,同时促进附近的组蛋白甲基化进行重编程,细胞内的Akt-mTOR信号通路也会被激活等[4]。当再次遇到同源或异源刺激时,巨噬细胞会产生更迅速和更强大的免疫反应以抵抗感染,保护机体。这表明训练免疫可赋予先天免疫细胞产生免疫记忆,对后续的细菌感染等能做出及时有效的免疫应答[5]。
败血症(sepsis)指致病菌进入血液并在其中繁殖,通过血液循环向全身扩散,从而引发全身性感染。败血症每年造成20万 ~ 30万人死亡,是导致发达国家和发展中国家人口死亡的主要因素之一[6]。败血症的病理进程分为两个部分,主要由细菌感染引发,首先是进入急性期,引发多种组织损伤和多器官衰竭,从而导致全身性功能障碍,该阶段称为全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS);急性期过后机体将产生抗炎因子以限制炎症反应的损害,该阶段称为代偿性抗炎综合征(compensatory antiinflammatory syndrome,CARS)[7]。在败血症晚期阶段的抗炎反应会压倒宿主,抵消宿主的初始反应,并可能导致全身性的免疫耐受。这种败血症引起的免疫耐受可以持续多年,使患者容易发生持续性和继发性感染,从而增加死亡率。
为了研究败血症的临床发病机制,并开发有效的治疗方式,需要使用一些有效的实验模型来模拟复制临床败血症患者的病症。以下几种模型常用来研究败血症:静脉注射脂多糖(LPS)、腹腔注射大肠杆菌(E.coli)以及盲肠结扎穿刺(CLP)[8]。目前使用最广泛的是CLP模型,与临床败血症病症具有高度的相容性。在该模型中,败血症起源于腹腔内的多种细菌感染,随后细菌易位进入血液,然后引发全身性的炎症反应[9]。CLP模型可重复性高,可以通过控制针头尺寸、盲肠穿刺次数和抗生素的使用来改变败血症的严重程度[10]。
目前败血症的治疗仍旧是一个难题,找到确切的分子机制有效治疗败血症是首要任务。训练免疫和免疫耐受是两种功能状态相反的免疫应答,目前鲜有研究报道通过诱导训练免疫来逆转败血症引发的免疫耐受状态。Novakovic等[11]发现βglucan加入到免疫系统不再发挥功能的受试验者的血液样品中,这些单核-巨噬细胞的免疫应答可于体外被重新激活。这表明应用训练免疫逆转免疫耐受状态可能是治疗败血症的可行策略。因此,本研究通过建立β-glucan训练免疫模型以及小鼠的CLP引起的免疫耐受模型,拟通过诱导训练免疫逆转免疫耐受并阐明其中的分子机制,为败血症治疗提供一种可行策略。
1.1 材料
1.1.1 实验动物
本论文涉及的所有雄鼠(86只)均是SPF级的C57BL/6J背景,平均周龄为8周,体重约为22 g,购买于厦门大学实验动物中心【SCXK(闽)2018-0003】。饲养于厦门大学实验动物中心的屏障环境中【SYXK(闽)2018-0009】,饲养期间各组小鼠自由饮水,保持pH = 6.0 ~ 8.5,饲喂由厦门大学实验动物中心提供的普通饲料。饲养环境:白光和暗光各12 h循环照射,温度恒定,温度控制在25℃左右,湿度:45% ~ 55%,换气:每小时6 ~ 15次。所有小鼠实验操作均通过动物保护与使用委员会审核批准,严格执行厦门大学实验动物中心(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)制定的动物福利保障条例,并履行动物实验伦理承诺(XMULAC20200219)。
1.1.2 主要试剂与仪器
β-glucan(实验室从白色念珠菌中自提),LPS(Invitrogen,tlrl-pb5lps),Mouse TNF-α ELISA试剂盒(Invitrogen,88-7324-76),Mouse IL-6 ELISA试剂盒(Invitrogen,88-7064-76),SYBR Green染料(AG,AG11701)。酶标仪(Biotek,美国),凝胶成像仪(赛智,中国),CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad,美国)。
1.2 方法
1.2.1 β-glucan在BMDM中训练免疫模型的建立
为了在体外建立训练免疫模型,因此分离C57BL/6J小鼠的胫骨,外源添加M-CSF刺激分化为成熟的巨噬细胞(bone marrow derivedmacrophage, BMDM),随后向成熟分化的BMDM中加入40 μg/mL的β-glucan,24 h后换液,加入含10 ng/mL M-CSF的DMEM再培养6 d,中间第3天需补加一半含10 ng/mL M-CSF的DMEM。6 d后将细胞消化,用100 ng/mL LPS再次刺激4 h和24 h。
1.2.2 β-glucan诱导的体内训练免疫模型
感染前的第7天和第4天采用腹腔注射的方式注射200 μL体积1 mg的β-glucan,共注射2次,在7 d的时候感染致死剂量104CFUs的金黄色葡糖球菌(Staphylococcusaureus115-69)。
1.2.3 CLP模型
为了探究如何改善败血症引发的免疫耐受,CLP手术在本研究用于建立败血症免疫耐受模型,操作与先前文献报道一致[9]。简单来说,手术前给小鼠腹腔注射与体重相适应的1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg)以麻醉(单位:μL)。腹部的毛发用剃毛器剃除以暴露腹部皮肤,随后依次剪开表皮和内皮,伤口大小为1 cm左右,找到盲肠,随后用医用真丝编织线(上海金环医疗用品股份有限公司)结扎,然后用注射器对穿一次后挤出1 mm的粪便。结扎的位置和穿刺注射器的大小根据实验所需要的死亡率而定。随后将盲肠还原至腹腔,然后依次缝合内皮和外皮。手术结束,背部皮下注射1 mL 37℃的生理盐水,以面部朝下的姿势,热照灯照射小鼠1 ~ 3 h左右,以恢复麻醉引起的常规体温过低。
1.2.4 抗生素治疗
CLP手术2 h后小鼠接受1次抗生素治疗,随后在手术后的第1天和第2天(共3次),背部皮下注射1 mL 25 mg/kg的抗生素亚胺培南(源叶,S26289)。对照组注射1 mL的含5%葡萄糖的乳酸林格氏液(5% dextrose in lactated ringer’s solution,D5W)。亚胺培南的使用能够有效减少CLP后血液中细菌的数量,其剂量依照先前CLP模型和临床使用情况[12-13]。
1.2.5 蛋白质免疫印迹
106个细胞加入150 μL蛋白裂解液(1 mmol/L tris-HCl, 0.3 mol/L NaCl,0.01% SDS,1.5% NP40,120 mmol/L deoxycholate,1 mol/L MgCl2,含蛋白酶磷酸酶抑制剂),冰上裂解20 min后离心取上清。加入上样缓冲液制备蛋白样品,95℃加热使其变性。加入10 μL的蛋白样品到10%的SDS-PAGE凝胶中,90 ~ 130 V的电压值跑样。湿法转膜,恒压100 V转膜90 min。转膜结束后用5% BSA室温封闭1 h,之后敷上相应一抗于4℃摇床上,过夜。使用的一抗包括p70 S6 Kinase Antibody(Rabbit,CST,9202S),Phospho-p70 S6 Kinase(Thr389)Antibody(Rabbit,CST,9205S),4E-BP1(53H11)Rabbit mAb(Rabbit,CST,9644S),Phospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4)Rabbit mAb(Rabbit,CST,2855L),m-TOR Antibody(Rabbit,CST,2972S),Phospho-mTOR(Ser2448)Antibody (Rabbit,CST,2971S),稀释比为1∶1000,β-tubulin(Mouse,SAB,48352)的稀释比为1∶5000。第2天室温孵育对应一抗来源的辣根过氧化物(HRP)标记的二抗,最后使用ECL(四正柏,4AW012-500)显色。
1.2.6 细胞因子、乳酸和NO测定
细胞上清液中的细胞因子使用商业化的TNF-α(Invitrogen,88-7324-76)和IL-6(Invitrogen,88-7064-76)ELISA试剂盒,操作按照说明书。乳酸测定方案中,乳酸与酶混合物(乳酸氧化酶和HRP)特异性反应生成产物,该产物与Amplex red(sigma,119171-73-2)相互作用生成颜色和荧光(Ex/Em=535/590 nm)。NO测定按照Griess法。
1.2.7 mRNA的提取和RT-PCR
在第6天,经训练后的细胞用100 ng/mL LPS刺激4 h后收集RNA。mRNA的提取采用磁珠法,105个细胞中加入150 μL裂解液(100 mmol/L Tris-HCl pH = 7.5, 0.5 mol/L LiCl,10 mmol/L EDTA,1.5% SDS,5 mmol/L DTT),取120 μL加入6μL磁珠(Biotin-oligo dT streptavidin magnetic beads)室温结合5 min;置磁力架上待液体澄清,弃掉上清;随后用洗涤液A(10 mmol/L Tris-HCl pH = 7.5,0.15 mol/L LiCl,1 mmol/L EDTA,0.1% SDS)洗涤1次,洗涤液B(10 mmol/L Tris-HCl pH = 7.5,0.15 mol/L LiCl,1 mmol/L EDTA)洗2次,最后加入15 μL Tris-HCl(10 mmol/L,pH = 7.5)于80℃加热2 min洗脱。cDNA合成使用碧云天dNTP(D7366),RNase抑制剂(AG11608)和逆转录酶(AG11605)。RTPCR使用SYBR Green 染料(AG,AG11701),操作按照说明书进行。
1.3 统计学分析
所有实验均采用随机分配的小鼠进行,不设研究者盲法。实验的细节可以在结果中找到。所有数据点和“n”值反映了生物复制(即小鼠)。使用GraphPad Prism 8.0.3.2软件进行统计分析,结果用平均值 ± 标准差(±s)表示。以P< 0.05表示差异具有显著性。
2.1 β-glucan在BMDM中训练免疫模型的建立
虽然先前科学家们在人源单核细胞中已成功建立训练免疫模型,但是为了进一步理清训练免疫模型的机制,小鼠作为比较好的模式动物,建立小鼠训练免疫模型能够为研究训练免疫机制带来便利。因此,首要目标是在BMDM中建立一个细胞模型来验证训练免疫反应的形成(图1A)。训练免疫能够促进先天免疫细胞炎症因子的表达。先前研究表明,在败血症的早期阶段,训练免疫能够促进巨噬细胞发生M1型极化[14]。结果表明,β-glucan训练增强BMDM促炎因子TNF-α和IL-6的产生(图1B)。同时,通过qPCR检测LPS刺激4 h后抽提的mRNA在TNF和IL-6在转录水平上的差异。结果表明,在转录水平上经β-glucan训练的BMDM炎症因子TNF并没有显著性差异,然而IL-6显著高于未被训练的BMDM(图1C)。在先天免疫细胞中,巨噬细胞使最早观察到产生一氧化氮(NO)的细胞,NO发挥其抗菌抗炎的作用以清除病毒、细菌和真菌等感染[15]。因此,通过Griess法检测了训练前后BMDM产生NO的水平差异。结果表明,与未训练的BMDM相比,当LPS再次刺激时,训练后的BMDM产生NO的水平明显高于未被训练的BMDM(图1D)。从形态学上观察,β-glucan训练后使BMDM增大。同时,将细胞消化下来用自动细胞计数仪(Automated Cell Counter LUNA II)检测细胞直径。从数值上看,经过β-glucan训练的BMDM直径明显大于对照组(图1E)。提示细胞内的m-TOR信号通路有可能被活化,因此通过蛋白质免疫印迹法检测了m-TOR及其下游调控蛋白质合成的靶蛋白磷蛋白70核糖体蛋白S6激酶(phosphoprotein 70 ribosomal protein S6 kinase-1,p70s6k)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1),该通路的活化表现为p70s6k和4EBP1磷酸化。结果显示,βglucan训练会增强m-TOR、p70s6k和4EBP1的磷酸化。考虑到训练免疫的代谢基础是有氧糖酵解,研究也聚焦于糖酵解相关蛋白即己糖激酶-1(Hexokinase-1,HK1)和己糖激酶-3(Hexokinase-3,HK3)的变化,结果表明β-glucan训练增加HK1和HK3的表达(图1F)。除此之外,乳酸在免疫调节中也能够发挥重要作用,研究也关注乳酸的变化。结果表明,β-glucan训练使BMDM产生更多的乳酸分泌于上清中(图1G)。
图1 β-glucan在BMDM中诱导的训练免疫Note. A. Schematic of in vitro β-glucan induced trained immunity experimental setup. B. Supernatant collected from 24 h LPS re-stimulation were measured by TNF-α and IL-6 commercial ELISA kit. C. mRNA level of TNF and IL-6 were measured by qPCR, cells collected from 4 h LPS restimulation. D. Supernatant collected from 24 h LPS re-stimulation were measured following Griess assay protocol. E. After RIMI or β-glucan trained, the cell images were snapped by microscope at a 20 fold magnification. F. Western Blot analysis the protein level of m-TOR, 4EBP1, p70s6k, HK1 and HK3. G. Supernatants collected from 24 h LPS re-stimulation were measured following lactate assay protocol.Figure 1 β-glucan induced trained immunity in BMDM
以上结果表明,在体外BMDM中成功建立了训练免疫模型,并且与先前人源单核细胞训练免疫模型一致[4]。
2.2 β-glucan体内诱导的训练免疫具有保护作用
先前研究成功在体外建立了训练免疫模型,因此进一步研究拟在体内建立训练免疫模型。以8周龄大的野生型C57BL/6J雄鼠作为实验对象,在金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus115-69,S.aureus115-69)感染的前7 d和前4 d腹腔注射β-glucan,每次每只为1 mg(见图2A)。结果表明,β-glucan在体内诱导的训练免疫能保护致病菌S.aureus115-69诱导的感染,提高小鼠的生存率(见图2B)。
图2 β-glucan在体内诱导的训练免疫能抵抗S.aureus的感染(n = 5)Note. A. The scheme of β-glucan induced trained immunity in vivo. B. The survival curve of S.aureus 115-69 in abdominal infection.Figure 2 β-glucan induced trained immunity protected from S.aureus infection(n = 5)
2.3 β-glucan在体外可逆转LPS诱导的免疫耐受
由于训练免疫能够促进免疫应答,因此对诱导训练免疫是否能够逆转免疫耐受进行了研究。首先,LPS刺激成熟分化的BMDM 24 h以引起巨噬细胞产生免疫耐受。随后,再用β-glucan刺激BMDM 24 h,换上含10 ng/mL M-CSF的DMEM静置培养BMDM 1 d。最后,再次用LPS刺激BMDM(图3A)。通过检测促炎细胞因子TNF-α和IL-6的变化水平来反映耐受的逆转情况。与耐受的BMDM相比,β-glucan逆转组产生的TNF-α和IL-6更高,甚至比原始状态下的BMDM还产生更多的促炎细胞因子(图3B,3C)。从RNA水平分析TNF和IL-6的变化也观察到一样的趋势,β-glucan逆转组TNF和IL-6基因表达在一定程度上得到恢复(图3D,3E)。同时检测了NO的分泌水平,β-glucan逆转组产生的一氧化氮明显高于耐受组,甚至比原始状态下的BMDM还要产生更多(图3F)。上述结果一致表明,在体外β-glucan能够逆转LPS诱导的免疫耐受。
图3 β-glucan逆转LPS诱导的免疫耐受Note. A. The in vitro BMDM tolerance reversal model, with β-glucan added therapeutically after 24 h of 100 ng/mL LPS exposure, let BMDM rested for 1 day and re-stimulated with LPS. B, C. Supernatant collected from 24 h LPS re-stimulation were measured by TNF-α and IL-6 commercial ELISA kit. D, E. mRNA level of TNF-α and IL-6 were measured by qPCR, cells collected from 4 h LPS re-stimulation. F. Supernatant collected from 24 h LPS restimulation were measured following Griess assay protocol.Figure 3 β-glucan can reverse LPS-induced immune tolerance
2.4 体内免疫耐受模型的建立
鉴于训练免疫能够在体外逆转免疫耐受,因此研究提出假设训练免疫同样能够逆转体内免疫耐受。通过给小鼠实施CLP手术引起多种微生物感染导致免疫耐受作为动物模型。在CLP手术(25 G,20%)7 d后,使小鼠感染一个非致死剂量的白色念珠菌(CandidaalbicansATCC MTA-3573(UC 820)),观察小鼠在此情形下是否处于免疫耐受状态(图4A)。结果显示,在CLP第7天感染时,CLP组的存活率都明显低于Sham组(图4B)。之前的报导显示血液中IL-6浓度可作为败血症死亡率的最佳预测因子[16],因此对术后6、24和48 h尾静脉采血分离的血清中IL-6的水平进行检测。结果表明,CLP组的IL-6会在术后6 h立即升高,在24 h后这种细胞因子引起的细胞风暴已经减少,直至48 h细胞因子风暴消失(图4C)。考虑到在CLP手术7 d后,小鼠大约有20%的致死率(图4D),因此改变盲肠结扎的位置以降低CLP组的致死率,同时CLP手术3 d后就感染剂量减半的C.albicans,以明确机体免疫耐受出现的最早时间(图5A)。结果显示,CLP组的存活率明显低于Sham组,而且在术后3 d感染减半的C.albicans致死现象比术后7 d感染更严重(图5B)。因此,CLP 3 d后的体内免疫耐受模型,可用于免疫耐受逆转的后续研究。
图5 体内免疫耐受模型的建立(n = 5,3 d)Note. A. The scheme of immune tolerance model in vivo, cecum was ligated (10%) and punctured once with a 25 G needle. B. The survival curves of C.albicans for tail vein infection 3 days after CLP.Figure 5 Establishment of an in vivo immune tolerance model(n = 5,3 d)
2.5 β-glucan在体内逆转免疫耐受的功能探索
构建体内免疫耐受模型选择的是在感染前3 d进行CLP手术,条件是在盲肠10%处结扎及用25 G的穿刺针对穿。β-glucan的治疗设为3组,分别为术后第1天、术后第2天、术后第1天和第2天同时给药,然后在术后的第3天进行非致死剂量的C.albicans感染(图6A)。从感染后的生存状况来看,与PBS组相比,β-glucan治疗组的生存率没有显著改变,并且与β-glucan干预治疗的时间前后或者次数没有太大相关性(图6B)。感染3 h后尾静脉采血,检测小鼠体内促炎细胞因子IL-6的产生水平,与PBS组相比,β-glucan治疗组的小鼠产生的IL-6也没有改变(图6C)。这个结果与生存曲线一致,说明在体内β-glucan的治疗并不能像体外一样通过恢复促炎细胞因子的产生来逆转免疫耐受状态,从而提高抗感染时的生存率。
图6 β-glucan在体内逆转免疫耐受的功能探索(n=4~5)Note. A. Diagram of experimental design model. B. The survival curve 3 days post CLP after infected with 105 CFUs C.albicans through tail vein.C. The serum IL-6 level 3 h after infected with C.albicans.Figure 6 Functional exploration of β-glucan in reversing immune tolerance in vivo (n=4~5)
在败血症患者的急性期,为了控制病情医生会考虑给予抗生素治疗。为了更密切的模拟临床败血症,研究采用了另外一种CLP模型。在盲肠20%处结扎,用23 G的穿刺针对穿,致死率大约为40%的CLP模型[17]。然后在CLP手术后的2 h,第1天和第2天分别给抗生素治疗。抗生素亚胺培南(imipenem)对革兰氏阳性、阴性的需氧和厌氧菌具有抗菌作用,可用于敏感菌引起的败血症等[12]。在该CLP模型中亚胺培南的确能够减少死亡率,但对CLP引起的体重减轻症状没有缓解(图7A,7B)。根据2.2结果中证明了β-glucan在感染前7 d和前4 d的两次给药,能有效抵抗感染,具有保护作用,所以在感染前7 d和前4 d(即CLP手术后的第5天和第8天)给β-glucan治疗,在CLP手术后第12天时进行再次细菌感染(图7C)。结果表明,在此模型条件下,β-glucan的治疗也并不能完全逆转小鼠的免疫耐受状态,提高再次感染时的生存率(图7D,7E,7F)。
图7 β-glucan在体内逆转免疫耐受的功能探索Note. A. The survival curve after treatment with imipenem, CLP condition was cecum was ligated (20%) and punctured once with a 23 G needle(n=4). B. Weight loss after treatment with imipenem(n=4). C. The in vivo tolerance reversal model. D. The survival curve within 12 days after CLP(n=5). E. Weight loss within 12 days after CLP(n=5). F. The survival curve of 103 × CFUs S.aureus in abdominal infection(n=5).Figure 7 Functional exploration of β-glucan in reversing immune tolerance in vivo
总的来讲,目前探究从β-glucan治疗后小鼠的生存情况虽然没有得到改善,但是我们推测训练免疫的诱导可能通过改变体内先天免疫细胞的比例组成,进而改善体内免疫耐受状态,只是不足以从生存率上面体现。因此,关于β-glucan在体内是否能够逆转免疫耐受以及逆转耐受的机理还得需要继续探究。
β-glucan是体外和体内训练免疫的典型诱导剂,其刺激可使巨噬细胞具有长期的促炎表型,从而增强机体对再感染的免疫应答[5,18]。在这项研究结果中,证实了BMDM经β-glucan训练之后,当二次遇到同源或异源刺激时细胞内能产生更高水平的促炎因子TNF-α、IL-6,分泌更多的NO;细胞代谢模式发生重要改变即向糖酵解转变,分泌更多的乳酸;细胞内的m-TOR信号通路活化。同时,经过β-glucan训练的小鼠能够有效抵抗S.aureus的感染。
与训练免疫相反的功能状态是免疫耐受,耐受细胞的基因转录处于无法激活的状态,并且再刺激时无法发挥其功能。败血症在细胞因子风暴结束后,进入第二阶段免疫耐受。免疫耐受状态的逆转引起了研究者的关注,因为从炎症阻断治疗方面来降低败血症的整体死亡率的成功案例有限,并且因为大多数败血症的死亡往往发生在耐受阶段期间的医院二次感染[19]。巨噬细胞经训练免疫诱导可以对继发感染产生更强的吞噬反应,这种反应可以由多种微生物相关分子模式(MAMP)诱导,例如白色念珠菌、卡介苗(BCG)和β-glucan[2,11]。根据训练免疫和免疫耐受的功能特点,想通过在已经处于免疫耐受的细胞中,加入能够诱导训练免疫的物质,探究细胞的免疫耐受状态是否可以被逆转。假设β-glucan是可以逆转免疫耐受的。在免疫耐受逆转的体外研究结果中,β-glucan在一定程度上确实能够逆转LPS诱导的免疫耐受。已有研究发现,LPS诱导耐受的巨噬细胞和β-glucan训练过的巨噬细胞具有不同的表观遗传和代谢模式[11]。
有研究表明,IFN-γ可以部分恢复从败血症患者体内分离的耐受单核细胞的代谢功能[20]。因此,想在体内探究β-glucan是否能够改变由CLP诱导的免疫耐受状态,从而提高再次感染时的存活率。进一步用CLP模型模拟败血症,在感染金黄色葡萄球菌之前给β-glucan治疗,但β-glucan并没有提高CLP组再感染时的存活率。随之,又重新建立一种联合抗生素亚胺培南治疗的CLP模型,在此情形下,β-glucan治疗的CLP组的生存率与PBS治疗的CLP组相比,没有显著性差异。虽然在体内应用βglucan逆转没有得到预期的实验结果,但是证实了先天免疫“训练者”β-glucan在体外可以逆转巨噬细胞免疫耐受。
针对进一步体内免疫耐受逆转的研究,考虑是否β-glucan改变了一些免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞等的比例组成,以及这些细胞的反应性改变。有研究表明,在由E.coli感染引起的腹膜炎中,经酵母聚糖训练的小鼠,其腹腔细胞组成由维持稳态的大腹腔巨噬细胞向促炎的小腹腔巨噬细胞转变[5]。此外,宿主的单核细胞数目增多可介导白色念珠菌诱导的训练免疫,增强宿主二次感染免疫应答能力[2]。因此,我们提出假设细胞群表型和特定细胞群数量的改变可能在介导训练免疫反应中起关键作用。
综上所述,成功地在小鼠BMDM中用β-glucan建立了体外训练免疫模型。之后建立了CLP免疫耐受模型,确定一个能够导致免疫耐受但致死率低的条件,以及致死率过半但联合抗生素治疗能够减少死亡率的条件。在体外中证明了β-glucan能够逆转LPS诱导的免疫耐受,验证了β-glucan在体内能够有效抵抗金黄色葡萄球菌的感染。但是目前结果尚未证明β-glucan能够逆转CLP诱导的免疫耐受,提高二次感染时的存活率。
猜你喜欢免疫耐受败血症诱导生物标志物对新生儿败血症早期诊断的研究进展现代临床医学(2022年5期)2022-09-28慢性HBV感染免疫耐受期患者应精准抗病毒治疗临床肝胆病杂志(2021年5期)2021-12-23动态监测脾脏大小和肝硬度值协助判断慢性HBV感染免疫耐受期患者是否需要抗病毒治疗临床肝胆病杂志(2021年5期)2021-12-23HBV感染免疫耐受期患者不建议抗病毒治疗临床肝胆病杂志(2021年4期)2021-12-22齐次核诱导的p进制积分算子及其应用数学物理学报(2021年4期)2021-08-30全球和我国HBV感染免疫耐受期患者人数估计更正说明临床肝胆病杂志(2021年4期)2021-04-19同角三角函数关系及诱导公式新世纪智能(数学备考)(2020年10期)2021-01-04急性烂鳃、套肠、败血症…一旦治疗不及时，死亡率或高达90%，叉尾鮰真的值得养吗?当代水产(2019年8期)2019-10-12续断水提液诱导HeLa细胞的凋亡中成药(2017年12期)2018-01-19大型诱导标在隧道夜间照明中的应用中国交通信息化(2017年8期)2017-06-06