钟丽梅，韦武均，黄晶晶，胡仁统，林成，黎作茶，韦家柱，陈晓昊，周律
(1. 右江民族医学院附属医院急诊科，广西 百色533000；
2. 右江民族医学院附属医院临床检验诊断研究中心，广西 百色 533000；
3. 广西肝胆疾病临床医学研究中心，广西 百色 533000；
4. 广西百色市妇幼保健院保健科，广西 百色 533000；
5. 右江民族医学院附属医院肿瘤科，广西 百色 533000)
乙型肝炎(hepatitis B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis bvirus，HBV)感染所致临床常见的传染性疾病。如果治疗不及时，可演变成肝衰竭、肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病[1]。据WHO统计[2-4]，全球约有2.4亿人感染HBV，每年全球死亡人数高达100万。中亚和东亚是HBV高发地区，我国形势尤为严峻，成年HBV携带者超过8 000万。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎均为临床常见的病毒性肝炎，与免疫系统在试图清除病毒的过程中对肝细胞产生的攻击有关，活化的T细胞产生过度免疫反应。而急、慢性乙型肝炎患者的单个核细胞基因表达差异尚不清楚。转录组测序是通过提取样本RNA，通过打断并测序的方式，高通量地检测每个基因的表达丰度，并可以通过生物信息学，对差异基因进行分析，从而得到差异的功能与通路[5]。本研究收集急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)和慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的外周血样本，比较单个核细胞基因表达差异，以此探讨急、慢性肝炎单个核基因的基因表达谱差异，为临床急、慢性肝炎的诊断和治疗提供理论基础。
1.1 研究对象 选取2019年6月至2020年8月在右江民族医学院附属医院就诊，使用EDTA抗凝采血管采集的AHB 3例和CHB 3例的外周血。AHB诊断标准：既往无乙型肝炎病史或HBsAg阳性记录，现1个月内检查HBsAg和HBVDNA为阳性者。CHB诊断标准：既往有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月，现HBsAg和HBVDNA仍为阳性者。2组临床特征资料见表1，经统计分析，两组性别、年龄、HbsAg与HBVDNA差异均无统计学意义，具有可比性。
表1 两组临床特征资料
1.2 单个核细胞分离 新鲜全血加入等体积PBS，上下颠倒充分混匀；
适量加入淋巴细胞分离液(solarbio)，20 ℃，3 000 g离心30 min；
分离已静置分层的白细胞层，20倍体积的Trizol试剂加入白细胞中，反复抽打混合液直至整个溶液呈现清亮不黏稠的状态，-80 ℃保存。
1.3 RNA提取与测序 使用Trizol(Invitrogen)提取总RNA。使用Agilent 2100分析仪(Agilent Technologies)检测RNA质量，并用无RNase琼脂糖凝胶电泳进行检查。质检合格的总RNA去除核糖体RNA以保留mRNA。使用片段缓冲液将富集的mRNA片段化，使用随机引物反转录为cDNA。加入DNA聚合酶Ⅰ，dNTP(用dUTP代替dTTP)RNase H和缓冲液合成第二链cDNA，QiaQuick PCR试剂盒(Qiagen)将cDNA片段纯化，添加poly(A)进行末端修复，并连接至Illumina测序接头。接着使用UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)消化第二链cDNA。通过琼脂糖凝胶电泳选择消化产物的大小，PCR扩增，使用Illumina HiSeqTM 4000测序。
1.4 生物信息学分析 将测序结果剔除接头、核糖体RNA与低质量的数据，利用软件Stringtie(1.3.4版)进行转录本的重建，该软件与HISAT2 (2.1.0版本)一起鉴定出已知mRNA和新mRNA。通过cuffdiff(https：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffd-iff/index.html)和FPKM(每百万个映射读取的转录本每千碱基片段中的片段)读数对筛选出的转录本进行了定量分析。采用FDR<0.05且|log2FC|>1两个标准筛选两组样本的差异表达基因。对差异基因进行GO(gene ontology，基因本体论)功能与KEGG(京都基因与基因组百科全书)信号通路聚类分析。
2.1 差异表达基因筛选 以P<0.05和│fold change│>2作为标准，AHB组和CHB组样本相比共筛选出725个差异表达基因，其中上调的基因有372个，下调的有353个。差异基因热图，见图1。表达量上调最多的5个基因依次为：TOMM20L、SPANXN5、HTR3A、PIK3CG和HSD3B1；
表达量下降最多的5个基因依次为：CD36、AP000295.1、UGT1A5、UTS2B和CEACAM21，见表1。
图1 差异基因热图
表2 差异上调或下调的基因(前5个)
2.2 差异基因GO功能分析 经过GO富集分析，AHB患者、CHB患者差异基因主要集中在生物学过程(18个)和细胞组分(2个)方面，而在分子功能方面无明显差异，见图2。按基因数多少进行排序，生物学过程前5个功能分别是：微管发生功能(tube development，GO：0035295)、内源性刺激反应功能(response to endogenous stimulus，GO：0009719)、组织发生功能(tissue development，GO：0009888)、细胞增殖调控功能(regulation of cell proliferation，GO：0042127)与细胞增殖功能(cell proliferation，GO：0008283)；
两个细胞组分功能为细胞外区域功能(extracellular region part，GO：0044421)和(extracellular region，GO：0005576)。
2.3 差异基因KEGG信号通路富集 差异mRNA主要富集的KEGG信号通路，按q value进行排序，前5个信号通路分别是：PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、硫胺素代谢通路(thiamine metabolism)、癌症转录失调(transcriptional misregulation in cancers)和IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)，见图3。
图2 差异基因GO功能聚类图
图3 差异基因KEGG信号通路聚类图
AHB、CHB的发病都是由于免疫系统清除或试图清除病毒过程中对肝细胞的攻击造成的，然而AHB和CHB存在着明显的流行病学和组织病理学差异。AHB发病时，虽然肝脏损伤指标大幅升高，但病毒往往已经被大部分清除；
而CHB发病时，除肝损伤外，还伴随着高滴度的病毒[6-7]。预示着AHB和CHB可能存在明显的基因表达差异。本研究收集AHB和CHB患者的外周血样本，进行转录组测序，结果发现，AHB组和CHB组共有725个差异表达基因，其中上调的有372个，下调的有353个。表达量上调最多的5个基因依次为：TOMM20L、SPANXN5、HTR3A、PIK3CG和HSD3B1；
表达量下降最多的5个基因依次为：CD36、AP000295.1、UGT1A5、UTS2B和CEACAM。
在表达上调的基因中，TOMM20L基因在重度抑郁症中高表达[8]。五羟色胺受体HTR3A则被多篇报道证实与精神分裂、抑郁症、酒精成瘾、肺癌等多种疾病的发生发展相关[9-11]，PIK3CG则在动脉粥样硬化和胃癌组织中表达异常，是前列腺癌和乳腺癌的潜在治疗靶点[12-13]。而HSD3B1基因则与前列腺癌和高血压相关[14-15]。而本研究证实这些基因在AHB中高表达，提示其高表达可能与AHB相关，而通过反基因锁核酸等方式进行关键上调基因的沉默，可能可以抑制HBV相关疾病进展[16]。在表达下降的基因中，脂肪酸转位酶CD36参与了某些病毒的复制、组装、储存和分泌，如丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)，然而，CD36与HBV生命周期的关系尚不清楚[17-18]。本研究中，CD36在AHB中表达下调，可能与HBV病毒复制相关。CEACAM蛋白是一种黏附在细胞膜表面的跨膜糖蛋白分子，通过调节细胞的间紧密连接表达影响着恶性肿瘤的分化和侵袭[19-20]。
本研究中，通过对差异表达基因进行GO功能分析，发现差异基因主要富集的GO功能在微管发生功能、内源性刺激反应功能、组织发生功能、细胞增殖调控功能与细胞增殖功能和细胞外区域功能。差异基因主要富集的KEGG信号通路在PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、硫胺素代谢通路、癌症转录失调和IL-17信号通路，其中PI3K-Akt和IL-17信号通路在乙型肝炎中起到重要作用[21-22]，其将是后续研究的重点。第二代测序结果显示，血浆中HBV Pre-S2缺失(第1～54位核苷酸)的肝癌患者，手术切除后容易复发[23]，HBV患者肠道菌群的α多态性略有增加，共47株菌株具有潜在的生物标志物功能[24]，深度测序显示了HBV可发展成肝癌[25]。本研究也存在不足之处：①对于芯片测序差异基因表达，需要进一步扩大临床样本，并进行qPCR验证，并根据临床生理病理与差异基因表达统计，分析差异基因的临床意义；
②针对差异基因进行过表达或沉默载体转染，验证其功能与机制；
③研究表明，丙肝、酒精肝等肝病会干扰乙肝相关疾病的诊断[26-27]，本研究中未设置相关对照组进行排除，后期扩大样本验证会设置丙肝、酒精肝、正常人等对照组进行参照研究；
④针对发现的差异功能与通路，需要进一步的体内外实验证明其与AHB或CHB的关系，或设计对应的抑制剂探讨用于治疗的可能。
总之，本研究提供了AHB和CHB患者外周血单个核细胞中差异基因表达变化的一般情况与可能调控功能和通路，筛选出的差异基因和相关信号通路在AHB和CHB的疾病进展中起到重要作用，本课题组将在今后的实验中进行深入探讨，有助于阐明乙型肝炎的潜在机制。
猜你喜欢差异基因乙型肝炎测序慢性乙型肝炎抗病毒治疗是关键肝博士(2022年3期)2022-06-30外显子组测序助力产前诊断胎儿骨骼发育不良中国生殖健康(2020年4期)2021-01-18基于RNA 测序研究人参二醇对大鼠心血管内皮细胞基因表达的影响 （正文见第26 页）心电与循环(2020年1期)2020-02-27中草药DNA条形码高通量基因测序一体机验收会在京召开中国现代中药(2019年5期)2019-07-03基因测序技术研究进展科海故事博览·下旬刊(2019年6期)2019-04-16外显子组测序助力产前诊断胎儿骨骼发育不良中国生殖健康(2018年4期)2018-11-06慢性乙型肝炎的预防与治疗中国医药指南(2017年3期)2017-11-13紫檀芪处理对酿酒酵母基因组表达变化的影响江苏农业科学(2017年5期)2017-04-15SSH技术在丝状真菌功能基因筛选中的应用湖北农业科学(2014年3期)2014-07-21中西医结合治疗慢性乙型肝炎肝纤维化66例中国中医药现代远程教育(2014年13期)2014-03-01