许有嫔 吉冰璇 王林叶 张启军
摘要：穗粒数是构成作物产量的三大要素之一，与作物产量具有显著的正相关关系，定位、克隆与穗粒数有关的新基因为解析作物产量构成具有十分重要的意义。利用穗颈注射法将高粱基因组DNA导入水稻品种9311中，在后代筛选到1个稀穗突变体，暂定名为lax3。研究了该突变体的主要农艺性状和稀穗的遗传方式，并对该稀穗突变基因进行了精细定位。研究结果表明，该稀穗突变体lax3在株高、分蘖、枝梗和穗粒数上与受体9311相比存在显著的差异。遗传分析表明该突变体的稀穗性状受1对隐性核基因控制，用lax3/02428 F2群体将该基因初步定位在水稻第4染色体上，位于SSR标记RM16335和RM16424之间，交换单株分别为5株和3株。通过扩大遗传群体和进一步开发标记，最后将该基因定位在RM16349和Indel标记In4-8之间，兩者之间的物理距离约为96.9 kb。本研究结果为进一步克隆该基因、解析水稻穗粒结构调控机制和分子辅助选育奠定一定的基础。
关键词：水稻；
稀穗；
lax3（t）基因；
精细定位
中图分类号：S511.032文献标志码：A文章编号：1002-1302（2023）11-0087-05
水稻作为全世界一半以上人口的主粮，其产量对保障全球粮食安全和维持世界社会稳定具有十分重要的作用。作物产量是由分蘖数、每穗粒数和粒质量三因素共同决定的［1］，水稻的穗分枝数则直接决定着穗粒数，因此，研究调控水稻穗分枝形成机制不仅能解决植物发育相关的基本问题，还对作物产量的提高有着重要作用［2-3］。水稻属于圆锥花序，包含一个主穗轴、螺旋状环绕在主轴上的一级枝梗、以两行交错方式着生在一级枝梗上的二级枝梗，以及一、二级枝梗末端着生的小花，每个小花则由退化颖壳、护颖、内稃和外稃、雌蕊和雄蕊构成［3-5］，任何一个影响水稻花序的因子都可能影响其最终产量。
参与水稻幼穗发育的基因可分为调控枝梗分生组织的形成、枝梗分生组织的大小、小穗分生组织的转变时间以及枝梗的伸长这4类［3，5-6］，而枝梗分生组织的形成过程是整个水稻幼穗发育的基础，后期水稻枝梗的有无、多少、空间布局都是由枝梗分生组织的发育决定的。目前报道的参与水稻枝梗分生组织起始的基因主要有LAX1、LAX2、SPA、FZP、MOC1和SPL基因家族。LAX1（Lax Panicle 1）编码一个植物特有的bHLH转录因子，lax1突变体的穗部分枝和种子减少，严重时则只有穗轴，不产生枝梗，并且不结实［7-9］。LAX2也被称为Gnp4 （Grain Number Per-Panicle 4），编码1个核蛋白，该核蛋白含有植物特异的保守结构域，与LAX1互作一起参与调控水稻腋生分生组织的形成［10-11］。lax2突变体和lax1突变体的表型极为相似，穗部分枝减少，侧生小穗消失［2，10］。而lax1/lax2双突变体在前期内完全不分蘖，而后期二级枝梗及在一级枝梗上着生的小穗的发育则被完全抑制［10］。SPA（Small Panicle）虽是LAX1的功能冗余基因，但也控制水稻腋生分生组织的产生。spa突变体的穗分枝数、二级枝梗数和每穗小穗数都有所减少，且一级枝梗变短并缺失显著［8］。MOC1（Monoculm 1）基因通过控制整个生育期内腋生分生组织的形成从而影响其分蘖数和穗部枝梗的数目。mocl突变体由于不能正常启动腋芽的发育，导致其除主茎外完全没有任何其他分蘖［12］。虽然LAX1、LAX2和MOC1三者之间存在功能冗余，但是任意2个基因同时缺失时均会严重抑制分蘖芽的起始［10］，其三者之间具体的调控机制还是不清楚，需要更多研究来进一步揭示；
MOC3可能与前三者共同调控水稻分蘖芽的起始，但它主要在侧生分生组织形成的早期表达，而在侧生分生组织形成后消失，可能位于MOC1或LAX1的下游，也可能通过另外一条途径参与分蘖芽形成的调控［13-14］。
FZP（Frizzy panicle）是玉米BD1基因在水稻中的同源基因［15］，它通过抑制小穗分生组织内腋生分生组织的过度生长来维持从小穗分生组织到终端小穗的转换。由于fzp2突变体的终端小穗分生组织和侧生小穗分生组织退化的时间点被阻断，导致原本应发育的小穗及花器官无法起始生长，本应该形成小穗的部位被二级枝梗代替，最终表现为穗轴过度分枝［16-17］。双突变体lax1/fzp2则表现为二级和二级以上枝梗、终端小穗等结构完全消失，表明LAX1基因和FZP2基因分别作用于2条独立的通路来完成对水稻穗型的控制［7］。
SPL（squamosa promoter binding protein like）基因家族是植物特有的转录因子，其中SPL7、SPL14和SPL17这3个在穗部高表达的基因都是通过RCN（reduced culm number）来调控穗型结构［18］。SPL14和SPL17的RNAi干扰株系表现出穗枝梗数和小穗数明显下降，说明SPLs能正向调控花序和分枝分生组织的活性；
进一步研究显示，SPL14能够直接调控PAP2（panicle phytomer 2），即OsMADS34基因［19］，OsMADS34的转录起始于花序发育第一期，在花序分生组织和枝梗分生组织的发育早期开始积累［20］，其突变体表现为一次枝梗数目增加，二次枝梗上的籽粒变小，结实率降低［21］。最近被鉴定的基因CPB1（Clustered Primary Branch 1），为D11（DWARF11）新的等位基因，其突变体cpb1表现为穗部一级枝梗簇生，小穗数减少［22］。而D11属于细胞色素P450家族，参与油菜素内酯的生物合成途径，该激素如何调控水稻的枝梗分化和发育还不是很清楚［22］。
尽管目前已经报道了一些调控水稻枝梗分生组织形成的基因，然而，穗粒数的形成不但受前期营养生长期的发育限制，其营养生长转向生殖生长本身也是一个十分复杂的生物学过程，受到很多因素协作调控［3-6，23］，部分基因的作用机理还不清楚，比如虽然LAX1在生长素介导的花序形态发生中起着重要作用，但其作用方式仍不清楚，仅知其在新的分生组织形成时以非细胞自主性的方式行使功能［7］，故要完全解析水稻枝梗形成的调控机理还需要不断发掘新的更多相关的基因。
1材料与方法
1.1试验材料
本研究中使用的水稻材料稀穗突变体、9311和02428材料均由笔者所在单位保存。在水稻叶枕平期，将来源于杂交高粱吉杂123的基因组总DNA从穗颈处直接注射到优良恢复系9311的幼穗中［24］，从其后代M4群体中选育出稳定遗传的稀穗突变体，暂命名为lax3。
分别构建lax3与9311和02428正反交制备F1，并套袋自交繁衍为F2群体，播种、单株移栽都在江苏省农业科学院南京水稻试验田中进行，并按水稻常规栽培管理。
1.2试验方法
1.2.1突变体与野生型部分农艺性状调查按照文献［25］的记载方法和要求在水稻成熟期分别对突变体lax3和野生型9311进行株高、分蘖数、有效分蘖数、穗粒数、一次枝梗数和二次枝梗数进行调查、统计，然后采用卡方检验二者在这些农艺性状上是否具有显著差异。
1.2.2遗传分析利用lax3/02428 F2群体中186个隐性单株作为初定位群体，同时在整个分离群体的齐穗末期选取正常穗和稀穗各10株提取基因组总DNA各自等量混合，分别构建正常穗和稀穗近等基因池。随后选取多态性丰富且均匀分布在水稻12条染色体的160对SSR引物对亲本02428与稀穗lax3的基因组总DNA进行多态性分析，筛选出在这2个材料之间具有多态性的引物；
用这些在亲本间具有多态性的引物进一步筛选出在正常穗和稀穗近等基因池上具有多态性的引物用于该稀穗突变体基因的初定位。
在初定位的基础上通过扩大定位群体，即选用lax3/02428 F2群体中697株稀穗单株来进行该基因的精细定位。在初定位区域内进行引物加密合成，同时开发目标区域内新的InDel标记。InDel标记的开发是根据已公布的水稻测序品种9311和日本晴在初定位区间内存在的插入或缺失位点信息进行设计新的SSR引物，即选取某差异位点两端各200 bp左右的一段日本晴基因组DNA序列，再利用Primer Primer 5.0软件设计能完全覆盖差异位点新的SSR分子标记。
在开发出新的InDel标记的基础上，先在2个亲本间筛选出具有多态性差异的InDel标记，然后在近等基因池上进一步验证其多态性差异，最后选择在近等基因池上具有差异的分子标记在扩大的隐性单株群体上进行PCR和聚丙烯凝胶电泳分析，统计各个分子标记在群体上的单交换数量，用于基因的连锁遗传分析。
2结果与分析
2.1突变体lax3的农艺性状表现
在水稻的营养生长期，突变体与野生型9311之间的农艺性状差异不大，主要差异表现株高和分蘖上，突变体lax3较9311的株高矮些，分蘖也少些。在水稻的抽穗灌浆期，突变体的株高比野生型9311平均矮9.3 cm，而播抽期相差不大；
从后期室内考种结果看，突变体lax3无论是在（有效）分蘖数、一、二次枝梗数上还是每穗总粒数上都显著低于野生型9311（图1和表1）。该突变体整个生育期农艺性状表现类似于已经报道过稀穗突变体lax1-1［26］和lax2-1［10］，三者的共同点都是单株分蘖数、二级枝梗数和每穗粒数显著减少，其主要区别在于本研究中的突变体其一级枝梗数较野生型也是显著减少的，而突变体lax1-1的一级枝梗数相对于野生型是不变的或者差异不显著，lax2-1的一次枝梗数反而是增加的，且二級枝梗上不着生小穗［10，26］。
2.2基因定位
通过观察lax3/9311正反交和lax3/02428正反交F1的穗部表型均为正常穗型，说明该突变体穗部性状受隐性核基因控制；
进一步分别统计lax3/9311和lax3/02428 F2群体正常穗与稀穗的分离比例基本上是3 ∶1（表2），符合1对基因的遗传规律，故此推断本研究中突变体lax3的稀穗性状受1对隐性核基因控制。
选取均匀分布在水稻12条染色体的160对SSR引物对亲本02428与稀穗的DNA进行多态性分析，结果筛选出在lax3与02428之间具有多态性的引物68对，其多态性频率为42.5%；
进一步用lax3/02428的F2分离群体构建的正常穗与稀穗近等基因池进行验证，结果位于水稻第4染色体上的引物RM16335和RM16963仍然具有良好多态性，初步认为该基因位于水稻第4染色体上。
随机选取lax3/02428 F2群体的186个稀穗单株作为初级定位群体。在SSR引物RM16335与RM16963之间按照一定的间隔距离合成新的引物，验证、选取新合成的在亲本间和近等基因池间都具有多态性的引物进行初级定位群体的标记分析，进一步将lax3（t）基因定位在SSR标记RM16335和RM16424之间，各自的单交换单株数分别为5株和3株。随后根据已测序水稻品种9311和日本晴在基因组DNA上碱基差异，重新设计一系列的InDel标记（表3），并选用lax3/02428 F2群体的697个稀穗单株进行精细定位，最终将lax3（t）基因定位在InDel标记In4-8与SSR标记RM16349之间，二者在日本晴基因组上的物理距离约为96.9 kb（表3和图2）。
3讨论与结论
已经克隆的lax2基因虽然同样被定位在水稻第4染色体上［10］，而且二者的农艺性状也具有一定的相似性，但二者还是存在一定的性状差异：lax2-1相对于野生型其一级枝梗数是增加的，lax3相对于野生型9311的一级枝梗数却是显著减少的；
而且突变体lax2与野生型之间没有碱基差异，只是在lax2预测基因启动子的CpG岛区域，其胞嘧啶的甲基化水平在突变体和野生型存在差异［11］，故要从核苷酸序列上很难确定lax3（t）是否是lax2的等位基因。
從前面lax3（t）基因的定位结果看（以日本晴基因组作为参考），lax3（t）被定位在水稻第4染色体短臂的1 808 228～1 905 169区域（表3），而lax2基因（19 564 239～19 566 320）位于第4染色体的长臂上，二者之间物理间隔约17.66 Mb，从这个意义上来讲，lax3（t）不大可能是lax2的等位基因。另外，通过对突变体lax3基因组重测序发现，lax3（t） 基因与野生型9311在定位区间内存在碱基替换与插入的情况，如部分碱基替换发生在基因BGIOSGA015671的外显子区域，通过碱基翻译模拟发现，该碱基替换可能导致该基因的终止子缺失，从而产生比野生型基因更长的蛋白质链（另文报道），至于其功能与作用还有待于更进一步的研究。故此，本研究认为lax3（t）不是lax2的等位基因，而是水稻稀穗类型的一个新基因。
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