许天宇,夏 涛,王晓菡
齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院 生物基材料与绿色造纸国家重点实验室,山东 济南 250353
随着我国经济的飞速发展,工业活动日益频繁,农田重金属污染状况加剧,耕地Cd和As污染面积呈现上升的态势[1-3]。2014年全国土壤污染调查报告显示,我国土壤污染形势严峻,耕地重金属点位超标率为19.4%,且以轻中度污染为主。重金属As和Cd作为耕地土壤主要污染物,点位超标率分别为2.7%和7.0%[4]。耕地重(类)金属污染破坏土壤结构,影响植物生长,造成农作物减产,品质降低。此外,重金属被植物吸收、富集,进而通过食物链威胁人类健康[5-6]。
小麦(Triticumaestivum)是世界主要粮食作物之一,我国是最大的小麦生产国和消费国。土壤重金属通过小麦根部富集到其体内,影响小麦正常生长和发育,造成作物减产,并危害人体健康。降低土壤Cd生物有效性、减少小麦As和Cd含量已成为国内外研究热点与难点之一[7-8]。原位钝化修复技术利用钝化材料通过对重金属离子进行吸附沉淀、络合、离子交换、氧化还原等作用改变重金属的赋存形态,降低其在环境中的活性、迁移性及生物可利用性,可以有效阻隔重金属向植物体内的转移,在不影响作物生产的同时进行修复,是一种针对中轻度重(类)金属污染土壤的安全有效修复技术。其中植物促生细菌通过成膜作用和分泌胞外聚合物等途径,赋予植物对重金属胁迫的抗性。同时,植物促生细菌通过增加土壤pH值、土壤有机质含量、提高土壤酶活性等方式减少重金属含量,改善土壤结构,从而缓解重金属对农作物的毒害,并且还可促进植物生长,改善土壤生态环境,环境友好,因此受到广泛关注[9-11]。研究发现,NeorhizobiumhuautlenseT1-17能降低辣椒根际水溶态Cd和Pb含量,从而减少果实中Cd和Pb的含量[12]。KocuriaflavaAB402和BacillusvietnamensisAB403形成生物膜,高效吸附As,减少水稻(OryzasativaIR64)对As的吸收[13]。但目前利用植物促生细菌阻控小麦吸收Cd和As的研究较少,土壤中功能基因和功能微生物的响应机制仍有待深入探讨。
本研究以重(类)金属抗性细菌RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11为实验材料,通过盆栽试验,研究Cd和As复合污染下菌株对小麦Cd和As含量的影响,并分析根际土壤中Cd和As的化学形态、细菌As代谢基因aioA、arsC、arsM和铁锰氧化细菌Leptothrixspp.丰度的变化,用以阐明菌株Q2-8和Q3-11对土壤Cd和As形态分布的影响,为实现中轻度重金属污染农田土壤的“边修复,边生产”提供理论依据和有益的技术策略。
1.1 供试材料
供试菌株为实验室保存菌株RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11。菌株Q2-8和Q3-11能产IAA(33.0 mg·L-1)和铁载体,对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)和Cd抗性分别为20～30 mmol·L-1、300～380 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1。选用我国广泛种植的扬麦16(TriticumaestivumL.cv.Yangmai 16)(YM 16)为供试小麦。
采集齐鲁工业大学温室基地无重(类)金属污染的农田耕作层土壤作为供试土壤,土壤基本理化性质为:有机质含量为22.3 g·kg-1,阳离子交换量为146 mmol·kg-1,有效态P含量为0.35 mg·kg-1,pH 6.85。配置Na3AsO4·12H2O和CdCl2·2.5H2O溶液加入到阴干后的土壤中,模拟Cd+As的复合污染。设置3组处理,分别为:无Cd和As污染,低浓度复合污染(1 mg·kg-1Cd+40 mg·kg-1As),高浓度复合污染(2 mg·kg-1Cd+60 mg·kg-1As)。将土壤混匀,黑暗条件下放置60 d,期间保持土壤温度为25 ℃,湿度保持为20%。
1.2 盆栽试验设置
扬麦16种子经过表面消毒处理后进行萌芽,选择长势一致种苗移栽至装有5 kg土壤的盆中,每盆6株。每隔一天补充去离子水,保持土壤湿润,每盆浇水量一致。生长15 d后分别按1%(108cfu mL-1)接种菌株Q2-8或Q3-11,以不接菌作为对照(CK)。每组三个重复处理。培养65 d后,收集分蘖期小麦。
1.3 植物样品分析
1.3.1 小麦生物量测定
小麦采收后,分成地上和根两部分并清洗干净,根部浸泡于0.01 mol/L EDTA-2Na溶液中10 min,去除表面残存的重金属离子,去离子水充分冲洗干净。样品置于烘箱105 ℃杀青半小时,再80 ℃烘干至恒重,称量地上部和根部干重。
1.3.2 小麦中Cd和As含量测定
取烘干至恒重的小麦种子研磨,研磨后的样品置于消解管,以硝酸-高氯酸消解法进行消解,用5% HNO3定容。使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)(Optima 2100 DV,PerkinElmer,USA)测定小麦根、茎叶中Cd含量[14],采用氢化物原子荧光法(HG-AFS)(JiTian SA-20D,China)测定As含量[15]。
1.4 小麦根际土壤样品分析
1.4.1 Cd和As的形态及提取方法
这与Nakahara（2012）的（27）式相对应，但在弱衰减的近似计算中，格林函数要展开到κ／k的一次项为止，而且要取0次贝塞尔函数与一次纽曼函数参数设为零时的极限。利用以上算法，当只剩下κ／k的一次项后，由（20）可导出：
使用Tessier分级提取法稍作修改对土壤中Cd形态进行分级提取[16]。具体提取方法见表1。
表1 土壤Cd分级提取步骤
每级提取完成后,用去离子水充分洗涤残留物,在5 000 r/min条件下离心15 min。将上述上清液经过滤后与提取液进行混合,测定Cd的含量。如表1所示,第一步得到的是金属可交换态Cd;第二步提取后,得到的为碳酸盐结合态Cd;第三步获得的是铁锰氧化物结合态Cd;第四步为有机结合态Cd。
土壤中As的分级提取采用Wenzel等的方法[17]。具体提取方法和步骤见表2。
表2 Wenzel法提取步骤
用0.05 mol/L NaCl清洗上一级的提取物,5 000 r/min离心15 min,将上清液与相对应的提取液混合,测定As含量。根据提取顺序,土壤中As的形态分别为非专性吸附态As、专性吸附态As、无定型铁铝氧化物结合态As和晶质合铁铝氧化物结合态As。
1.4.2 细菌As代谢基因相对丰度分析
称取0.5 g土壤样品,按照E.Z.N.A.© Soil DNA Kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.) 所提供的操作步骤,提取土壤细菌的总DNA。PCR扩增土壤中细菌代谢As相关基因aioA、arsC和arsM,所使用的引物和退火温度如表3[18]。采用QuantStudioTM7荧光定量PCR仪(Life Technologies Inc.,Carlsbad,CA,USA)检测aioA、arsC和arsM的相对丰度。
表3 aioA,arsC,arsM和细菌16S rRNA基因引物序列
1.4.3Leptothrixspp.相对丰度分析
参照Burger等[19]的方法测定Leptothrixspp.相对丰度,所用引物为PSP-6:5’-CAGTAGTGGGGGATAGCC-3’,DSP-6:5’-GATTTCTTCCCTGACAAAAGC-3’。
1.5 数据分析
使用SPSS 22.0软件进行数据分析,各处理差异显著性分析使用最小显著性差异法(LSD)分析(p<0.05),使用Microsoft Office 2016软件制表、作图。
2.1 菌株对小麦生长的影响
从图1可以看出,菌株Q2-8和Q3-11在无重金属污染的情况下可以促进分蘖期扬麦16的生长。与不接菌对照相比,接种菌株Q2-8和Q3-11在低浓度(1 mg·kg-1Cd+40 mg·kg-1As)和高浓度(2 mg·kg-1Cd+60 mg·kg-1As)Cd+As复合污染下都显著(p<0.05)提高了小麦根部和地上部的生物量,其中根部生物量提升了21%～37%,地上部提升了19%～32%。上述结果表明,在中、低浓度重(类)金属胁迫下,接种菌株Q2-8和Q3-11能够促进分蘖期小麦的生长发育,有效缓解重(类)金属对植物的损伤,这些菌株具有植物促生菌的特性。
图1 接菌处理对小麦组织生物量的影响(*,p<0.05)
2.2 菌株对小麦As和Cd含量的影响
由图2可知,在Cd+As复合污染下,小麦根和茎积累了高浓度的Cd和As,且根部重金属含量大于茎部的含量。重(类)金属浓度越高,小麦体内所积累的As和Cd含量也越高。在高浓度Cd+As复合污染处理下,与不接菌的对照相比,接种菌株Q2-8和Q3-11的处理,其小麦根部和地上部Cd含量显著(p<0.05)降低了21%～30%和28%～35%,小麦根部和地上部As含量显著(p<0.05)降低了29%～35%和25%～38%。研究结果表明,接菌处理可以阻隔分蘖期小麦对Cd和As的吸收。
图2 接菌处理对小麦组织Cd和As含量的影响(*,p<0.05)
2.3 菌株对小麦根际土壤As和Cd形态分布的影响
重金属元素在土壤中的形态直接影响其生物有效性,其中可交换态及碳酸盐结合态重(类)金属水溶性强,易迁移,可以通过根部富集在植物体内,危害生态环境。而土壤铁锰氧化态和有机结合态较为稳定,不容易被生物体吸收。因此,研究重(类)金属在土壤中的赋存形态对于土壤的生态修复具有重要意义。重金属Cd在土壤中的主要存在形态为有效态Cd,铁锰氧化态Cd含量次之。重金属As在土壤中的赋存形态以含量计依次为,结晶水合铁铝氧化物结合态As、专性吸附态As、弱结晶水合铁铝氧化物结合态A、非专性吸附态As。研究发现,在Cd和As污染条件下,与不接菌对照相比,接种菌株Q2-8和Q3-11的小麦根际土壤中有效态Cd和As含量显著(p<0.05)降低,其中土壤有效态Cd下降了20%～22%,有效态As下降了22%～27%。同时,根际土壤铁锰氧化态Cd和专性吸附态As含量显著(p<0.05)上升,分别为34%～46%和38%～39%。
表4 接菌处理对小麦根际土壤中Cd和As形态分布的影响(*,p<0.05)
2.4 菌株对小麦根际土壤中细菌As代谢基因相对丰度的影响
对小麦根际土壤中细菌As(Ⅲ)氧化酶基因aioA、As(Ⅴ)还原酶基因arsC和As(Ⅲ)的S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶基因arsM的相对丰度进行了测定和分析。细菌16S rRNA的基因检测效率为93.3%,而aioA、arsC和arsM基因检测效率分别为93.2%,99.2%和100.4%。由图3可知,aioA基因相对丰度最高,arsM基因相对丰度最低。与不接菌对照相比,接菌处理的As(Ⅲ)氧化酶基因aioA相对丰度无显著变化。低浓度Cd+As复合污染下,与不接菌对照相比,接种菌株Q2-8和Q3-11处理的arsM基因的相对丰度呈现显著的上升趋势。而在高浓度Cd+As复合污染条件下,与不接菌对照相比,接种菌株Q2-8和Q3-11显著(p<0.05)促进了arsC和arsM基因的上调。由此推测,接种菌株Q2-8和Q3-11可能促使As的形态发生转化,转化为生物毒性较低的价态,从而降低了重金属土壤中有效态As的含量。
图3 小麦根际土壤aioA,arsC和arsM基因相对丰度(*,p<0.05)
2.5菌株对小麦根际土壤中Leptothrix spp.相对丰度的影响
Leptothrixspp.16S rRNA基因检测效率为102.5%。Cd+As复合污染没有显著影响Leptothrixspp.相对丰度。与不接菌对照相比,在低浓度Cd+As复合胁迫下,菌株Q3-11显著(p<0.05)提高了Leptothrixspp.的相对丰度;而在高浓度Cd+As复合污染胁迫条件下,接种菌株Q2-8和Q3-11显著(p<0.05)提高了Leptothrixspp.的相对丰度。上述结果表明,菌株Q2-8和Q3-11处理通过改变重金属离子赋存形态,提升土壤中铁锰氧化物的含量,以加速结合重金属的能力,从而降低重金属的迁移性。
图4 小麦根际土壤Leptothrix spp.相对丰度(*,p<0.05)
土壤中的重(类)金属通过农作物吸附、络合等作用富集在作物体内,严重威胁食品安全和人体健康。植物促生细菌对促进作物生长和阻隔重(类)金属转移有重要影响,是重(类)金属污染农田修复的研究热点[20-21]。本研究以功能菌株RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11为实验材料,研究其对生长于Cd和As复合污染土壤的分蘖期扬麦16 Cd和As含量的影响。结果表明,在高浓度(2 mg·kg-1Cd+60 mg·kg-1As)Cd+As复合污染下,菌株Q2-8和Q3-11能显著降低扬麦16中Cd和As的含量。类似的,已有研究证明植物促生细菌能够通过分泌胞外多糖聚合物吸附、沉淀重金属,降低作物体内重(类)金属含量,提高作物品质。如Comamonastestosteroni降低了小白菜根际土壤中Ni和Cd的含量,Chryseobacteriumsp.BH1能提高甜高粱地上和地下部分的生物量[22-23]。这些结果均表明,植物促生细菌在土壤重金属修复和促进植物生长等方面的主要作用。
土壤环境中As的形态变化和其生物有效性密切相关,不同形态的As表现出不同的稳定性、迁移性和毒性。土壤微生物通过一系列的氧化、还原和甲基化作用影响As的赋存形态,在As的形态转化中发挥重要作用[18,24]并影响其生物有效性。研究发现,与细菌As代谢相关的基因主要有As(Ⅲ)氧化基因aio(曾命名为aox/aso/aro)、As(Ⅴ)还原基因ars和As(Ⅲ)甲基化基因arsM[25]。研究发现,As(Ⅲ)氧化酶基因aioA在氧化性的土壤中,能够促使高毒性As(Ⅲ)氧化为低毒和生物利用性较低的As(Ⅴ)。由于As(Ⅴ)本身是阴离子,容易被土壤中的铁矿石等金属氧化物吸附,降低了水溶性砷的含量,因此降低了As的迁移性和生物有效性[26-27]。细菌arsC基因编码As(Ⅴ)还原酶发现有两种抵御As胁迫的机制[28],在有氧条件下,进入细胞质的As(Ⅴ)被还原为As(Ⅲ),一方面将As(Ⅲ)直接排出体外,另一方面通过加速As(Ⅲ)与巯基化合物的结合而解毒。本试验采用qPCR技术,对分蘖期扬麦16根际土壤细菌aioAarsC和arsM进行表达水平的测定与分析。结果表明,aioA相对丰度和多样性显著高于arsC和arsM,功能菌株Q2-8和Q3-11能够诱导根际土壤中As(Ⅲ)氧化细菌的形成,说明根际土壤细菌具有较高的As(Ⅲ)氧化能力。虽然在菌株Q2-8和Q3-11中未检测到arsC的表达,但在Cd+As复合胁迫条件下,菌株Q2-8和Q3-11显著提高了土壤中arsC的相对丰度,说明接菌处理可有效促进As(Ⅴ)还原细菌的产生,提升了生物体对As的外排能力,提高了其环境适应能力。同时,细菌将As(Ⅴ)还原为As(Ⅲ)排除体内,并通过后续的甲基化反应挥发,从而增加了植物抗As的胁迫能力。
在两株功能菌株中并没有发现arsM的显著表达,但接菌处理提高了根际土壤中arsM的相对丰度,说明菌株Q2-8和Q3-11能够提升含arsM基因细菌的相对丰度,增强土壤细菌潜在的As(Ⅲ)甲基化能力。在一定条件下,细菌利用转甲基酶催化土壤中重金属As发生甲基化反应,将As(Ⅲ)转化为甲基砷、二甲基砷和三甲基砷等可挥发性的含砷化合物,这些化合物释放至大气圈层中,从而减轻了重金属As在土壤中的毒害[23]。以上结果表明,接菌处理能显著上调As代谢相关基因,通过氧化还原反应和去甲基反应影响As的赋存形态,降低了As在土壤中的生物有效态和迁移性,减少了小麦对As的吸收,达到了绿色修复的目的。
Leptothrixspp.是一种好氧嗜中性铁氧化细菌,在水体和土壤中广泛分布。Leptothrixspp.不仅可以产生铁锰氧化物并停留在细菌表面,这种氧化物通过络合作用与土壤环境中的重金属离子结合,达到去除重金属离子生物毒性的目的。同时,Leptothrixspp.具有很强的氧化性,可以将可溶于水的二价锰离子氧化为稳定的四价锰离子,以减轻金属离子的毒害[29]。本研究发现,在高浓度Cd和As复合污染条件下,功能菌株Q2-8和Q3-11能够显著提升根际土壤微生物Leptothrixspp.的相对丰度。在功能菌株的富集作用下,好氧嗜中性铁氧化细菌将亚铁离子氧化为三价铁离子,促进土壤中铁锰氧化物的产生,有利于改善土壤菌落结构。沉积的铁锰氧化物通过提升细菌周围土壤环境的pH值和提升对于重金属Cd和As的吸附能力,可以有效控制重金属离子的迁移和富集。通过研究小麦根际土壤中Cd和As赋存形态,发现菌株Q2-8和Q3-11能显著降低小麦根际土壤有效态Cd和As的含量,显著提高根际土壤铁锰氧化态Cd和专性吸附态As的含量。而铁锰氧化物表面可发生As(Ⅲ)的氧化,从而加强对As的固定作用[30-31]。
(1)Cd+As复合污染下,功能菌株RalstoniaeutrophaQ2-8和PseudomonasentomophilaQ3-11可降低分蘖期扬麦16中Cd和As的含量。
(2)菌株Q2-8和Q3-11可降低小麦根际土壤有效态Cd和As的含量,并提高根际土壤铁锰氧化态Cd和专性吸附态As的含量。
(3)菌株Q2-8和Q3-11通过提高根际土壤中细菌As还原基因arsC和甲基转移酶基因arsM的相对丰度,以及提高铁锰氧化细菌Leptothrixspp.的相对丰度,影响土壤中Cd和As的形态分布,降低有效态Cd和As的含量。
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