章霞，徐志进，李伟业，殷小龙，王易帆，陈爽，马雪彬
(浙江省舟山市水产研究所，浙江 舟山 316000)
大黄鱼(Larimichthyscrocea)隶属于鲈形目(Perciformes)石首鱼科(Sciaenidae)黄鱼属(Larimichthys)，是中国海水养殖经济鱼类之一，养殖产量居中国海水鱼类养殖前列[1]。大黄鱼体质娇嫩，易受惊吓，常在养殖操作、养殖运输和商品运输过程中出现应激反应，亦常出现充血、掉鳞和受伤等现象，进而引发疾病甚至死亡，造成巨大的经济损失，这也是制约大黄鱼生鲜产业发展的重要原因[2-3]。因此，采用鱼用麻醉剂是抑制鱼类过度应激、有效避免损伤的重用手段。
烷基磺酸盐同位氨基苯甲酸乙酯(MS-222)具有易溶于水、使用浓度低、入静快、作用时间长和复苏快等特点，被世界各国广泛应用于各种鱼类的麻醉运输和日常养殖操作[4-5]。研究表明，体质量为2.5～3.0 g的长江刀鲚(Coilianasus)幼鱼在(25.0±0.5)℃水温下，理想的MS-222麻醉质量浓度为150 mg/L[6]；
体质量为(5.59±0.29)g的岩原鲤(Procyprisrabaudi)幼鱼在23～24 ℃的水温下，MS-222有效麻醉质量浓度为120～220 mg/L[7]；
体质量为(130±10)g的大口黑鲈(Micropterussalmoides)幼鱼在(28.0±0.5)℃水温下，MS-222的最适麻醉质量浓度为70 mg/L[8]，MS-222的麻醉效果被广泛认可。有关MS-222对大黄鱼的麻醉效果已有一些研究，如体质量为450～550 g的大黄鱼，MS-222有效麻醉质量浓度为50～60 mg/L，16 ℃条件下麻醉效果最稳定[9]；
体质量为(250.52±15.30)g的大黄鱼，在15 ℃条件下，用40 mg/L的MS-222进行麻醉模拟运输24 h后，复苏率可达90%[10]。但这些研究均是围绕大规格大黄鱼开展的相关麻醉研究，而针对小规格大黄鱼的相关研究并未见报道。而在实际养殖生产中，幼鱼运输、标记和科学研究时麻醉剂使用频繁，为降低损耗并科学应用，有针对性地开展幼鱼时期的麻醉效果研究具有重要意义。
本试验中，对大黄鱼幼鱼采用不同质量浓度的MS-222长时间静水麻醉，研究其对大黄鱼幼鱼机体的影响，并确定MS-222长时间静水麻醉幼鱼的有效剂量，以期为大黄鱼幼鱼长时间保活运输提供科学参考。
1.1 材料
试验用大黄鱼幼鱼体长为(18.01±0.82)cm，体质量为(97.97±9.56)g，由浙江省舟山市水产研究所朱家尖养殖基地提供，试验鱼体质健康、规格相近。试验前于玻璃钢养殖桶(400 L)中暂养 1 d。试验用水为无污染的清澈海水，pH为7.99，盐度为20±1，水温为(16±1)℃。试验用玻璃钢鱼桶(半径r= 0.40 m，高H=0.40 m，实际水位h=0.20 m)水体体积为100 L。
MS-222购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 麻醉试验 将MS-222溶于水，配成质量浓度为10、20、30、40、50、60、70 mg/L的麻醉液。
1)麻醉和复苏试验。将停食24 h的幼鱼从暂养的玻璃钢养殖桶(400 L)转移到盛有不同质量浓度的MS-222麻醉液养殖水体(100 L)中，每桶放10尾鱼，鱼水质量比约为1∶20，观察鱼体的活动情况，用秒表记录鱼体进入不同麻醉阶段的时间。结合在麻醉剂作用下幼鱼表现出的行为变化，参考张丽等[9]、魏锁成[11]和刘长琳等[12]的研究结果，将幼鱼麻醉过程分为6期，复苏过程分为4期(表1)。麻醉24 h后记录存活率，然后转入相同水温的清水中复苏。
表1 麻醉和复苏不同阶段鱼类的行为特征[9]Tab.1 Behavioural characteristics of fish at different stages of anesthesia and recovery
2)24 h静水麻醉试验。根据上述试验中麻醉程度、复苏时间及存活率，选择能使幼鱼进入镇静期的两组MS-222质量浓度(20.0、40.0 mg/L)，以及空白组(0 mg/L)开展长时间(24 h)静水麻醉试验，观察不同麻醉时间对幼鱼机体的影响。每组设3桶重复，每桶放18尾鱼。麻醉24 h后放在清水中复苏6 h，此时记为30 h。分别在试验的第1.5、3、6、12、24、30 h时从每组取3尾鱼，采集其血液、肝脏样品，用于生理生化指标测定。
1.2.2 理化指标测定 将血液样品以4 000 r/min离心20 min，抽取上清液测定血清中皮质醇浓度；
取肝脏样品测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力。
所有指标均使用商品化试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)进行测定，采用紫外-可见分光光度计测定其吸光度值。
1.2.3 组织结构观察
1)组织切片观察。用40 mg/L的MS-222麻醉幼鱼24 h后，解剖取其肝脏、鳃丝和脑组织，分别用体积分数为4%的多聚甲醛固定，再用体积分数为50%、70%、85%、95%的乙醇和无水乙醇逐级脱水，每级进行2 h；
石蜡包埋后，经过切片、苏木精-伊红(HE)染色、中性树胶封片等步骤，在光学显微镜下观察组织学特征。
2)电镜观察。用40 mg/L的MS-222麻醉幼鱼24 h后，解剖取其肝脏、鳃丝和脑组织，分别用体积分数为2.5%的戊二醛和1%的锇酸固定，梯度乙醇脱水；
用白胶包埋组织，烘干后先进行半薄切片(1 μm)，定位需观察的位置，随后进行超薄切片(80 nm)；
用体积分数为2%的醋酸铀饱和乙醇溶液避光染色8 min，用体积分数为70%的乙醇清洗3次，用超纯水清洗3次；
用质量分数为2.6%的枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min，再用超纯水清洗3次，滤纸稍吸干；
切片在室温下干燥过夜，用透射电镜(HITACHI HT7800)观察拍照。
1.3 数据处理
试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0软件对试验数据进行方差分析(one-way ANOVA)，用 Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2.1 不同质量浓度的MS-222对幼鱼的麻醉和复苏效果
不同质量浓度的MS-222对大黄鱼幼鱼的麻醉及复苏效果见表2。
从表2可见：鱼体最终的麻醉程度随着MS-222质量浓度的增加，麻醉时间逐渐缩短；
当MS-222质量浓度为10、20、30 mg/L时，幼鱼只能进入轻度镇静期(Ⅱ期)，无法进入最终麻醉状态；
当MS-222的质量浓度为40 mg/L时，幼鱼可进入深度镇静期(Ⅲ期)；
当MS-222的质量浓度为50 mg/L时，鱼体进入麻醉(Ⅳ～Ⅴ期)的时间均大于5 min；
当MS-222的质量浓度为60 mg/L时，鱼体进入麻醉(Ⅳ～Ⅴ期)时间小于5 min，并能进入深度麻醉期(Ⅵ期)，麻醉24 h后，该组幼鱼的复苏率仍为100%；
当MS-222的质量浓度为70 mg/L时，幼鱼能进入深度麻醉期(Ⅵ期)，但麻醉24 h后，幼鱼的复苏率仅为50%。
表2 不同浓度MS-222对幼鱼的麻醉及复苏效果(n=10)Tab.2 Anaesthetic and recovery effects of MS-222 on juvenile at different concentrations(n=10)
2.2 MS-222长时间麻醉对幼鱼组织结构的影响
用40 mg/L的MS-222麻醉24 h时，对大黄鱼幼鱼肝脏、鳃丝和脑组织结构的影响见图1、图2。组织切片观察显示：空白组幼鱼肝细胞有少数空泡，但细胞核完整，细胞排列有序(图1A)，而40 mg/L麻醉组出现肝细胞肿胀，部分肝细胞核溶解、消失，细胞核皱缩，核膜形变，胞浆嗜酸性下降，胞浆内脂质沉积(图1B)；
空白组幼鱼鳃丝排列整齐(图1C)，而40 mg/L麻醉组鳃丝的次级鳃丝远端肿胀，上皮细胞坏死，鳃丝内红细胞聚集，鳃丝膨大，红细胞渗出(图1D)；
空白组幼鱼脑组织神经元细胞质浓染，神经元细胞核明显(图1E)，而40 mg/L麻醉组脑组织疏松水肿神经元细胞质淡染，神经元细胞核不明显(图1F)。
A—空白组肝脏；
B—40 mg/L的MS-222麻醉组肝脏；
C—空白组鳃丝；
D—40 mg/L的MS-222麻醉组鳃丝；
E—空白组脑；
F—40 mg/L的MS-222麻醉组脑。a—核膜；
b—胞浆；
c—红细胞；
d—神经元细胞；
e—神经元细胞核。A—liver in blank group；
B—liver in 40 mg/L MS 222 anesthesia group；
C—gill in blank group；
D—gill in 40 mg/L MS 222 anesthesia group；
E—brain in blank group；
F—brain in 40 mg/L MS 222 anesthesia group. a—nuclear membrane；
b—cytoplasm；
c—red blood cell；
d—neuron；
e—neuronal nucleus.图1 麻醉24 h时幼鱼肝脏、鳃丝和脑的组织结构Fig.1 Histological structure of liver，gill filament and brain of juvenile under anesthesia for 24 hours
BC—胆小管；
N—细胞核；
LD—脂滴；
M—线粒体；
RER—粗面内质网；
Epc—上皮细胞；
BM—基底膜；
Cap—血管腔；
Enc—内皮细胞；
PC—柱细胞；
CCS—泌氯细胞。BC—bile canaliculus；
N—nucleus；
LD—lipid droplet；
M—mitochondria；
RER—rough endoplasmic reticulum；
Epc—epithelial cell；
BM—basement membrane；
Cap—capillary；
Enc—endothelial cells；
PC—pillar cell；
CCS—chloride secreting cells.图2 麻醉24 h时幼鱼肝脏、鳃丝和脑的超微结构Fig.2 Ultrastructure of liver，gill filament and brain of juvenile fish under anesthesia for 24 hours
组织超微结构观察显示：40 mg/L的MS-222麻醉组肝细胞明显水肿，整体呈崩解状态，细胞膜大面积破损、不连续，膜内低电子密度水肿区，胆小管迂曲、扩张；
细胞核染色质均匀、局部核周隙增宽，胞内可见较大量脂滴；
线粒体轻度肿胀，部分线粒体膜破损，基质外溢，粗面内质网轻度扩张(图2(a))。鳃丝鳃小片结构变形，局部鳃小片断裂，上皮细胞增生肥大，胞内可见较多脂滴；
基底膜厚薄不均一，局部复层化、连续，血管腔狭窄，其中可见较多血细胞，轻度栓塞；
内皮细胞局部脱落游离，柱细胞数量减少；
泌氯细胞明显水肿，细胞内质网明显扩张、空泡变性(图2(b))。脑中神经元细胞轻度水肿，细胞膜局部小区域破损、不连续，膜内基质分布均匀；
细胞核呈圆形，以常染色质为主，染色质均匀，线粒体轻度固缩，大多线粒体膜完整；
嵴存在，少量线粒体轻度固缩，膜内电子密度高，嵴扩张，粗面内质网未见明显扩张，表面可见核糖体附着(图2(c))。
2.3 MS-222质量浓度和麻醉时间对幼鱼血清皮质醇浓度和肝脏抗氧化酶活力的影响
2.3.1 皮质醇浓度 从图3可见：静水中的幼鱼经MS-222麻醉处理24 h内，20 mg/L麻醉组幼鱼血清皮质醇浓度大致呈现先增长后下降再增长的趋势，在1.5 h内皮质醇浓度迅速上升，且显著高于空白组、40 mg/L麻醉组(P<0.05)；
40 mg/L麻醉组在麻醉期间皮质醇浓度变化趋势与空白组较为一致，波动较小；
麻醉期间，空白组及20、40 mg/L麻醉组皮质醇峰值时间点分别为24、1.5、24 h，麻醉24 h时，3个麻醉组的血清皮质醇浓度相近(P>0.05)；
复苏6 h后，20、40 mg/L麻醉组幼鱼血清皮质醇浓度均恢复至空白组水平(P>0.05)。
标有不同字母者表示相同时间下不同麻醉组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。Means with different letters are significant differences at the same time in different MS-222 groups (P<0.05)and the means with the same letter are not significant differences(P>0.05)，et sequentia.图3 不同浓度麻醉组幼鱼血清皮质醇浓度的变化Fig.3 Changes in serum cortisol concentration of juvenile under different concentrations of MS-222
2.3.2 SOD活力 从图4(a)可见：MS-222对幼鱼肝脏中的SOD有显著性影响，总体上来看，20 mg/L麻醉组SOD活性变化较40 mg/L麻醉组变化更为剧烈，空白组则波动较小；
在麻醉的各个时间点，20、40 mg/L麻醉组SOD活性均显著高于空白组(P<0.05)；
复苏6 h后，20、40 mg/L麻醉组幼鱼SOD活性均恢复至空白组水平(P>0.05)。
图4 不同浓度麻醉组幼鱼肝脏SOD、CAT和GSH-Px活力的变化Fig.4 Changes in activities of SOD，CAT and GSH-Px in liver of juvenile under different concentrations of MS-222
2.3.3 CAT活力 从图4(b)可见：MS-222对幼鱼肝脏中的CAT活力有显著性影响，在1.5、3、12 h时，20 mg/L麻醉组CAT活力显著高于空白组(P<0.05)；
在1.5、24 h时，40 mg/L麻醉组幼鱼的CAT活力显著高于空白组(P<0.05)；
复苏6 h后，40 mg/L麻醉组幼鱼CAT活力恢复至空白组水平(P>0.05)。
2.3.4 GSH-Px活力 从图4(c)可见：MS-222对幼鱼肝脏中的GSH-Px活力有显著性影响，但影响出现的时间稍晚；
20 mg/L麻醉组GSH-Px活力在6 h时开始出现明显变化，在12、24时显著高于空白组(P<0.05)；
而40 mg/L麻醉组则在3 h时开始出现显著变化，且在3、12、24 h时显著高于空白组(P<0.05)，6 h时显著低于空白组(P<0.05)；
复苏6 h后，20 mg/L麻醉组幼鱼GSH-Px活力恢复至空白组水平(P>0.05)，而40 mg/L麻醉组则显著高于空白组(P<0.05)。
3.1 MS-222浓度对大黄鱼麻醉和复苏行为的影响
麻醉剂浓度直接影响对鱼类的麻醉效果，浓度过低起不到抗应激作用，浓度过高则容易引起鱼类休克甚至死亡。为此，探究不同应用条件、应用目的时的给药剂量对有效开展麻醉工作至关重要。有研究表明，体质量为(200±50)g的黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)，用20 mg/L的MS-222麻醉24 h时，存活率达到100%[13]；
体质量为(360.4±50)g的大口黑鲈静水麻醉24 h，MS-222的适宜质量浓度为50～60 mg/L[14]；
体质量为500～600 g的大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，在水温为8 ℃、鱼水质量比为1∶3条件下，40 mg/L的MS-222适用于鱼的长时间(24 h)运输[15]。张丽等[9]研究表明，体质量为450～550 g的大黄鱼在水温(10.5±0.5)℃下，MS-222麻醉的有效质量浓度为50～60 mg/L，且在16 ℃时大黄鱼进入麻醉所需时间最长，也最稳定。本试验中，体质量为(97.97±9.56)g的大黄鱼幼鱼在水温为(16±1)℃下，MS-222质量浓度为50～60 mg/L时，鱼体能进入深度麻醉期，麻醉24 h后大黄鱼幼鱼复苏率为100%，这与张丽等[9]的研究结果较为一致。而本研究中大黄鱼幼鱼麻醉24 h的MS-222适宜剂量(40 mg/L)高于黄颡鱼[13]，与大口黑鲈[14]、大菱鲆[15]相近，这是因为不同鱼种、规格、温度和麻醉时间等均会影响MS-222的使用浓度。如MS-222在50～70 mg/L时，对体质量为(83.3±7.8)g的大泷六线鱼(Hexagrammosotakii)幼鱼有良好的麻醉效果[16]；
体质量为(81.9±0.36)g的鹦鹉鱼(Amphilophuscitrinellus)长距离运输(12 h)时，MS-222麻醉的有效质量浓度为40 mg/L[17]；
在15、20、25 ℃下，体质量为260～530 g的圆斑星鲽(Veraspervariegates)成鱼，MS-222麻醉的有效质量浓度分别为180～300、160～280、150～230 mg/L[18]。因此，在开展实际生产活动时需科学参考、适当摸索后再用药。有研究认为，深度镇静期是运输的适宜时期[11]，麻醉期是试验操作的最佳时期[19]。根据本研究结果，后续对大黄鱼幼鱼长时间麻醉应用可选用小于40 mg/L的MS-222进行运输试验探索，养殖短暂性操作可选用小于60 mg/L的质量浓度进行试验探究。
3.2 MS-222长时间麻醉对大黄鱼组织结构的影响
鱼用麻醉剂是一类能不同程度地抑制鱼脑感觉中枢使鱼失去反射动作的物质。其作用原理是：首先抑制脑的皮质(触觉丧失期)，再作用于基底神经节与小脑(兴奋期)，最后作用于脊髓(麻醉期)[20]。适量的麻醉剂可降低鱼类耗氧率和氨氮排泄率，抑制鱼类的过度应激，有效减少操作中的损伤或死亡。但过量的MS-222进入鱼体后会富集在脾、肝脏等器官，并引起肝脏受损等问题，大剂量的麻醉剂也会麻痹呼吸和舒缩中枢，导致鱼体死亡，进而影响成活率[21-22]。孙伟红等[23]研究表明，体质量为(300±50)g的大菱鲆，在水温12～13 ℃下进行60 mg/L的MS-222暴露试验，在60 h时肌肉中MS-222的富集量达到最高值，平均为47.8 μg/g；
肝脏中的MS-222在50 h后基本平衡，平均最大富集量可达67.9 μg/g。朱敏[24]研究表明，大剂量MS-222会引起鱼体肝脏、神经中枢等方面出现问题。本研究中，组织切片显微观察和超微结构电镜观察结果表明，用MS-222麻醉24 h的大黄鱼幼鱼，肝细胞肿胀，细胞核皱缩，线粒体轻度肿胀，部分线粒体膜破损；
鳃丝的次级鳃丝远端肿胀，上皮细胞坏死，鳃丝内红细胞聚集，鳃丝膨大，红细胞渗出，泌氯细胞明显水肿，细胞内质网明显扩张、空泡变性；
脑组织中出现神经细胞固缩，组织疏松水肿，细胞膜局部小区域破损且不连续，少量线粒体轻度固缩等现象。推测用40 mg/L的MS-222麻醉24 h时，可能对大黄鱼肝脏、鳃丝和脑组织有一定损伤，但具体的损伤情况及机理还需从复苏养殖、分子毒理及蛋白质代谢等多方面对麻醉效应和富集消除规律进行后续研究。
3.3 MS-222长时间麻醉对大黄鱼理化指标的影响
鱼类各种酶类、代谢产物和血液指标可在某种程度上反映各组织或器官的功能变化，是重要的生理、毒理和病理学评价指标。鱼类的抗氧化系统中的小分子非酶抗氧化剂如SOD、CAT和GSH-Px等，可在鱼类处于胁迫的环境中使机体内过氧化氢分解，清除生物体内的过氧化氢[25]，这些指标可间接反映生物体生理上的变化。本试验表明，20、40 mg/L的MS-222对大黄鱼幼鱼肝脏抗氧化酶活力相较于空白组均有增强作用，这是因为在MS-222的胁迫下，鱼体产生了应激反应，前期呼吸加快，产生大量的自由基，从而引起清除自由基的抗氧化相关酶类活力增强。在麻醉复苏后，抗氧化相关酶活性又下降至空白组水平，可见，20、40 mg/L的MS-222对大黄鱼幼鱼肝脏的影响是可逆的，此时鱼体生理机能尚能维持正常运行。本试验结果与MS-222和丁香酚作用锦鲤(Cyprinuscarpio)的研究结果相似[26]。
血液中激素浓度的变化是鱼类应激反应的首要表现。在遭遇环境胁迫时，鱼体内的肾上腺素和皮质醇(酮)大量分泌，调节机体的代谢以维持生理平衡[27-28]。有研究表明，鱼体在受到麻醉后，血液皮质醇水平短时间内迅速升高[29]；
10～20 mg/L的MS-222适于大口黑鲈麻醉后进行运输，麻醉运输组血清皮质醇变化差异显著高于基础组[30]；
麻醉运输组与非麻醉运输组美洲鲥(Alosasapidissima)幼鱼血清中皮质醇的浓度均显著高于麻醉前的基础组[31]。本试验中，用20 mg/L的MS-222麻醉大黄鱼幼鱼后，血清皮质醇含量在1.5 h时内迅速升高且显著高于空白组，之后趋于平稳，这与上述结果一致；
而40 mg/L的MS-222麻醉组血清皮质醇浓度变化较为平稳，各个时间点与空白组无显著性差异，这可能是40 mg/L的MS-222降低了鱼体对外界刺激的反应能力。可见，MS-222 在抑制鱼体胁迫应激反应中起到了重要作用。
1)随着MS-222质量浓度的增加，大黄鱼幼鱼的麻醉时间逐渐缩短，且复苏整体时间延长。24 h的麻醉运输可选用质量浓度为40 mg/L的MS-222。
2)用40 mg/L的MS-222麻醉24 h，对大黄鱼幼鱼SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化应激酶活性的影响作用是可逆的，但对其组织结构可造成一定损伤，但不致死。今后还需从分子毒理及蛋白质代谢等多方面对MS-222的麻醉效应进行研究评估。
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