皮亚妮，王雨露，许笑阳，徐 虹，姜 娜，王 帆，陶艳艳，赵长青，4，5
1.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所（上海 201203）；
2.杭州市红十字会医院消化肝病科（浙江 杭州 310003）；
3.浙江中医药大学附属第二医院肝病、感染性疾病科（浙江 杭州 310005）；
4.上海市中医临床重点实验室（上海 201203）；
5.上海中医药大学附属曙光医院肝病科（上海 201203）
肝细胞在机体糖代谢中发挥重要的作用，维持血糖的相对稳定；
氧化应激导致肝细胞合成、分解或贮备糖原受损，从而导致血糖降低或血糖升高。研究［1］显示，减少氧化应激是预防和治疗糖代谢异常的关键所在。肝糖异方由扶正化瘀方（丹参、虫草菌丝、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子）和实脾方（黄芪、黄精、虎杖）组成，立足于“扶正化瘀”基础上加强“实脾”，是治疗肝源性糖尿病的临床有效中药复方。前期临床研究［2］发现，肝糖异方能有效改善肝硬化合并糖尿病患者糖代谢异常，疗效是对照组的2.575 倍，总有效率达到80.95 %。进一步研究发现，肝糖异方对肝源性糖尿病模型大鼠具有保肝和抗肝纤维化作用，并可降低血糖、纠正糖代谢异常；
肝糖异方还可显著降低肝组织丙二醛（MDA）含量和增加超氧化物歧化酶（SOD）含量，上调肝组织醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶1（HO-1）和谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）基因水平，提示该方具有一定的抗氧化作用。［3］有研究［4-6］显示，抗氧化治疗在防治肝损伤、改善糖代谢方面有重要作用。本研究以过氧化氢（H2O2）诱导大鼠肝细胞过氧化损伤模型［7-8］，探讨肝糖异方调控糖原合成通路，改善氧化应激所致糖代谢异常的作用机制。
1.1 材料
1.1.1 细胞 大鼠肝细胞（BRL-3A 细胞），购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库（批号：GNR10）。
1.1.2 药物与试剂 黄芪（批号：2016092302）、黄精（批号：2016082402）、虎杖（批号：2016092001），购于上海上药华宇实业有限公司，提取率为26 %；
扶正化瘀方浸膏粉（批号：170605），购于上海黄海制药有限责任公司，提取率为14.31 %。盐酸二甲双胍（批号：11668019），购于生工生物公司。药物配制：上述浸膏按表1 配制，称取100 μg 溶于1 mL 二甲基亚砜（DMSO）后混匀，存储浓度为100 mg/L，分装，-20 ℃保存；
使用时以无血清高糖培养基（DMEM）稀释。肝糖异方浸膏粉的质量控制采用高效液相色谱法（HPLC）检测，各成分计算结果见表2。
表1 肝糖异方组方
表2 肝糖异方浸膏粉成分
MDA 试剂盒，上海百蕊生物科技有限公司（批号：XF01926B）；
丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒，武汉华美公司（批号：CSB-E13024r、CSBE13023r）；
活性氧（ROS）试剂盒，碧云天生物技术有限公司（批号：S0033）；
糖原染色试剂盒，北京索莱宝生物科技公司（批号：
G1360）；
葡萄糖测试盒，南京建成生物工程研究所有限公司（批号：A154-1-1）；
二辛可宁酸（BCA）法蛋白定量试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司（批号：A045-4）；
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）活力检测试剂盒，日本同仁株式会社（批号：CK04）；
2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），美国MCE 公司（批号：HY-D0940）；
抗磷酸化糖原合成激酶-3β（p-GSK-3β）抗体、抗磷酸化FoxO1 转录因子（p-FoxO1）抗体、抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体，美国CST 公司（批号：5558、9461、8457）；
抗糖原合成激酶-3β（GSK-3β）抗体，美国Proteintech 公司（批号：22104-1-AP）；
抗FoxO1 转录因子（FoxO1）抗体 ，英国Abcam 公司（批号：AB52857）。
1.1.3 仪器 微孔板分光光度计，美国Bio-Tek公司（型号：Bio-Tek PowerWave XS）；
倒置显微镜，日本Olympus株式会社（型号：IX70）；
电子天平，德国Sartorius公司（型号：BSA224S-CW）；
全自动数码凝胶图像分析系统，上海天能生命科学有限公司（型号：Tanon 3500）。
1.2 细胞培养 BRL-3A 细胞用含10 %胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔（DMEM）高糖培养基培养，置于5 %CO2、37 ℃恒温培养箱中，根据生长状况进行传代培养，细胞生长至约80 %融合状态可用于实验。
1.3 分组与干预 实验设正常组、模型组、肝糖异方组、二甲双胍组，每组设3 个复孔，实验重复3 次。正常组加不含血清的DMEM 培养基；
除正常组外，其余各组先以500 μmol/L 的H2O2干预30 min 诱导细胞过氧化损伤模型，弃上清；
随后模型组更换不含血清的DMEM，肝糖异方组与二甲双胍组分别以肝糖异方（200 μg/L）及二甲双胍（5 mmol/L）与细胞共孵育48 h［9］。
1.4 检测指标与方法
1.4.1 细胞活力 采用CCK-8 法检测细胞活力。BRL-3A细胞以1×104个/孔接种于96孔板，培养24 h，设正常组、模型组、肝糖异方组、二甲双胍组，每个浓度均设3个复孔，药物孵育48 h，弃上清。按照CCK-8 原液∶DMEM=1∶10 的比例混匀，100 μL/孔，37 ℃、5 % CO2培养箱中孵育1 h，在450 nm 波长处读取各孔的吸光度（OD）值。计算公式：细胞活力（%）=（实验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）×100%。
1.4.2 ALT、AST 活性及MDA 水平 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测ALT、AST 活性及MDA 水平。BRL-3A 细胞以2×105个/孔接种于6 孔板造模后，药物干预48 h，收集细胞，超声破碎后离心收集上清。从4 ℃冰箱中取出试剂盒，在室温下复温30 min，用双蒸水将20 倍浓缩液稀释至1 倍。配置标准品，向96 孔板中分别加入50 μL 倍比稀释好的标准品、50 μL 各组上清，并立即加入50 μL 生一普遍物素标记抗体，在37 ℃恒温条件下摇床孵育1 h。孵育结束后，弃去上清，用洗涤液洗涤，重复3 次。每孔加入80 μL 的辣根过氧化物酶（HPR）标记亲和素，用新的胶条覆盖微滴定板，避光放入37 ℃的恒温摇床孵育30 min。弃去上清后用洗涤液洗涤，重复3 次。每孔加入100 μL 酶底物显色液，37 ℃避光孵育10 min。取出酶标板，每孔迅速加入50 μL 酶反应停止液终止反应。立即在450 nm 波长处测定各孔的OD 值，根据标准品及对应的OD 值分别计算ALT、AST活性及MDA水平。
1.4.3 ROS 水平 BRL-3A 细胞以2×105个/孔接种于6孔板造模后，药物干预48 h。用1∶1 000 无血清培养液稀释DCFH-DA浓度至10 μmol/L。弃细胞培养液，加入1.5 mL 稀释好的DCFH-DA 充分覆盖细胞。取1份不加探针的细胞设为阴性对照管。取1 份已加入探针的细胞设为阳性对照管，同时加入ROS供氢体（20～100 μmol/L）诱导细胞。37 ℃细胞培养箱内孵育30～60 min。吸弃培养液，用无血清细胞培养液将细胞洗涤3 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。将各组制备成相同浓度的细胞悬液，各取100 μL 细胞悬液用酶标仪检测荧光强度，激发波长485 nm，发射波长538 nm。与对照组荧光强度比较，逐时间点检测刺激前后荧光强弱，计算各组细胞内ROS变化。
1.4.4 糖原染色及葡萄糖浓度 BRL-3A 细胞以3×104
个/孔接种于48 孔板，待细胞融合至80%，造模30 min，药物干预48 h 后，细胞培养板中加入试剂盒中固定液固定10～15 min，细胞用水清洗并晾干。加入氧化剂，在室温下氧化15～20 min。自来水冲洗2 次，再用蒸馏水浸洗2 次，并晾干。加入希夫试剂并加盖遮光，置于室温阴暗条件下浸染10～20 min。流水冲洗2 min。加入苏木素染色液，复染1～2 min。清洗后晾干，封片镜下观察到细胞中糖原或多糖呈紫红色，核呈蓝色。
BRL-3A 细胞以8×105个/孔接种于24 孔板，培养24 h，设正常组、模型组、肝糖异方组、二甲双胍组，每个浓度均设6个复孔。细胞予药物孵育48 h后，留取细胞上清液，1 000 r/min 离心10 min，每孔加入待测样本2.5 μL，再加入250 μL工作液，37 ℃孵育10 min，在505 nm波长处测定各孔的OD 值，检测葡萄糖浓度。再用BCA法测定蛋白浓度进行定量，每孔加80 μL 细胞裂解液，收集混合液，离心取上清，按照BCA 工作液A 液∶B液=50∶1配制，每孔加入200 μL 工作液，37 ℃孵育30 min，在562 nm 波长处测定各孔的OD 值，得出每组蛋白浓度。计算公式：细胞上清中葡萄糖含量（mmol/g）=细胞上清中葡萄糖浓度（mmol/L）/蛋白浓度（g/L）。
1.4.5 p-GSK-3β/GSK-3β、p-FoxO1/FoxO1 蛋白表达采用Western blot 法检测细胞p-GSK-3 β/GSK-3 β、p-FoxO1/FoxO1 蛋白表达。3×105个/孔BRL-3A 细胞接种于10 cm培养皿中，药物处理48 h结束后，弃细胞培养液，加入200 μL 细胞组织快速裂解液冰上裂解，12 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清，并用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白（20 μL体系），经10 % 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，以5 %胎牛血清/吐温-磷酸盐缓冲溶液（TPBS）室温封闭1 h，分别加入p-GSK-3β（1∶1 000）、GSK-3β（1∶2 000）、p-FoxO1（1∶1 000）、FoxO1（1∶1 000）一抗4 ℃过夜， TPBS 清洗后加入HRP 标记的二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，TPBS 清洗后加入增强化学发光（ECL）试剂盒，按ECL 试剂盒说明进行显影，并以全自动数码凝胶图像分析系统分析。
1.5 统计学方法 实验数据采用SPSS 26.0统计软件分析，以GraphPad Prism 9作图。计量资料以±s表示，多组间两两比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用snk-q检验，各组与模型组比较采用Dunnett-t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2.1 对细胞活力的影响 0～200 μg/L 肝糖异方可明显促进BRL-3A 细胞活力（P<0.05）；
400 μg/L 肝糖异方可明显抑制细胞活力，提示0～200 μg/L 肝糖异方对BRL-3A细胞无毒性，浓度≥400 μg/L时肝糖异方具有一定的毒性作用。100 μg/L 与200 μg/L 间差异无统计学意义（P>0.05），但200 μg/L肝糖异方的细胞活力有升高的趋势，因此我们选择无毒浓度200 μg/L 作为后续研究肝糖异方的剂量。见图1A。
图1 不同浓度的肝糖异方及各组细胞活力比较
检测200 μg/L 肝糖异方对500 μmol/L H2O2诱导BRL-3A 过氧化损伤模型的影响，结果发现500 μmol/L H2O2可明显抑制细胞活力（P<0.05）；
200 μg/L肝糖异方可明显提高模型组的细胞活力（P<0.05），5 mmol/L二甲双胍对细胞活力有所改善但差异无统计学意义（P>0.05），肝糖异方改善肝细胞活力优于二甲双胍（P<0.05）。见图1B。
2.2 对肝细胞过氧化损伤的保护作用 与正常组比较，模型组ALT、AST、MDA 水平均明显升高（P<0.05）。与模型组比较，肝糖异方组ALT、AST、MDA 水平均明显降低（P<0.05）；
二甲双胍组ALT、AST 活性有所降低（P<0.05），MDA 含量有所降低但组间差异无统计学意义（P>0.05）。肝糖异方组下调ALT、AST、MDA 水平优于二甲双胍组（P<0.05）。见图2。
图2 各组ALT、AST、MDA水平比较
2.3 对氧化应激肝细胞ROS 水平的影响 与正常组比较，模型组、肝糖异方组和二甲双胍组ROS生成速率均明显升高（P<0.05）；
与模型组比较，肝糖异方组和二甲双胍组ROS 生成速率均明显降低（P<0.05）；
且肝糖异方组较二甲双胍组ROS 生成速率降低更为明显（P<0.05）。见图3。
图3 各组ROS生成水平比较
2.4 对氧化应激肝细胞糖原合成的影响 BRL-3A 细胞糖原染色结果显示：正常组肝细胞浆中紫红色糖原颗粒阳染明显；
模型组细胞阳染颗粒显著减少，着色较浅；
肝糖异方组肝细胞着色较模型组加深。上述提示肝糖异方可有效促进肝细胞糖原合成。见图4。
图4 各组糖原染色比较（过碘酸雪夫染色，×200）
细胞上清中葡萄糖含量研究结果显示：与正常组比较，模型组细胞上清中葡萄糖含量明显升高（P<0.05）；
与模型组比较，肝糖异方组与二甲双胍组细胞上清中葡萄糖含量显著下降（P<0.05）；
肝糖异方组与二甲双胍组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。
图5 各组细胞上清中葡萄糖含量比较
2.5 对BRL-3A细胞糖原合成信号通路的影响 与正常组比较，模型组p-GSK-3β/GSK-3β明显降低（P<0.05）；
与模型组比较，肝糖异方组和二甲双胍组的p-GSK-3β/GSK-3β明显升高（P<0.05）；
与肝糖异方组比较，二甲双胍组的p-GSK-3β/GSK-3β明显升高（P<0.05）。见图6。
图6 各组GSK-3β磷酸化情况比较
与正常组比较，模型组的p-FoxO1/FoxO1 明显降低（P<0.05）；
与模型组比较，肝糖异方组和二甲双胍组的p-FoxO1/FoxO1 均明显升高（P<0.05）；
与肝糖异方组比较，二甲双胍组的p-FoxO1/FoxO1差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。
图7 各组FoxO1磷酸化情况比较
肝源性糖尿病泛指继发于各种慢性肝实质损害的糖尿病，由于肝细胞受损导致胰岛素抵抗及代谢异常而引起的糖代谢紊乱，也是肝硬化的重要并发症之一［10-11］。前期研究［12］提示，肝源性糖尿病的基本病机为“脾虚、血瘀、肝郁”，针对此病机，我们建立了肝糖异方。肝糖异方由扶正化瘀方和实脾方共同组成，立足于“扶正化瘀”基础上加强“实脾”，是治疗肝源性糖尿病的临床有效中药复方。二甲双胍是临床治疗糖尿病的一线药物，具有抗氧化及控制血糖的作用，且无肝损伤报道［13-14］。研究［15］表明，氧化应激与肝细胞损伤及肝脏糖原合成有重要关系。H2O2是一种强氧化剂，可以打破细胞氧化-抗氧化平衡系统，常用于体外氧化损伤模型的建立。已有研究［16］表明，H2O2能引起肝细胞的氧化损伤。因此，抗氧化治疗在防治肝损伤、改善糖代谢方面具有重要意义。前期研究［3］表明，肝糖异方具有较好的抗氧化活性及改善糖代谢的作用。本研究采用H2O2诱导的BRL-3A 细胞损伤模型，探讨肝糖异方改善肝细胞过氧化损伤所致糖代谢异常的作用机制。
本研究结果显示，BRL-3A 细胞经H2O2诱导后细胞活力显著下降，而细胞培养液中的ALT 和AST 活力显著升高，这表明H2O2对BRL-3A细胞具有明显的损伤作用。200 μg/L 肝糖异方和5 mmol/L 二甲双胍可以增加细胞活力，降低ALT 和AST 水平，对肝细胞具有一定的保护作用，且200 μg/L 肝糖异方效果优于二甲双胍。此外，利用CCK-8 法检测肝糖异方单独作用对BRL-3A细胞活性的影响，结果显示，0～200 μg/L 肝糖异方对BRL-3A细胞无毒性，浓度≥400 μg/L时肝糖异方具有一定的毒性作用，因此本研究选择200 μg/L 作为后续研究肝糖异方的剂量。进一步的研究结果发现，经H2O2损伤后BRL-3A 细胞中的MDA 和ROS 水平显著增加，而与模型组相比，肝糖异方组和二甲双胍组上述指标都得到了不同程度的改善，且肝糖异方效果优于二甲双胍。肝糖异方可以通过降低细胞内的ROS 水平，减少由ROS 触发的氧化应激造成的脂质过氧化产物MDA 水平的增加来抵御氧化应激产生的损伤，对H2O2诱导的BRL-3A 细胞损伤起保护作用。另外糖原染色结果显示，经H2O2刺激后的肝细胞阳染颗粒显著减少，着色较浅，肝糖异方组肝细胞着色较模型组加深。细胞上清中葡萄糖含量检测结果显示，经H2O2刺激后的细胞上清中葡萄糖含量明显升高，与模型组相比，肝糖异方组可降低细胞上清中葡萄糖含量，提示肝糖异方可有效促进模型组糖原合成，使细胞上清中葡萄糖含量降低，进而达到调节血糖的作用。综上可见，肝糖异方可通过影响酶类和非酶类抗氧化物来保护肝细胞发挥重要的抗氧化及调节糖代谢的作用。
GSK-3β 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在肝糖代谢中发挥重要作用。在正常状态下，GSK-3β 磷酸化后活性被抑制，糖原合成酶去磷酸化活性上升，糖原合成增加，维持机体正常血糖水平［17］；
当GSK-3β过表达时则会出现糖耐量异常［18］。GSK-3β通过使糖原合酶（GS）磷酸化而抑制其活性，使糖原合成减少。因此通过抑制GSK-3β 的活性，使GS 活性增加，促进细胞外葡萄糖向糖原的转化，可以降低血糖。肝脏维持体内血糖水平稳定主要依靠糖原分解及糖异生。Ferrer 等［19］发现，可以通过上调GSK-3β 磷酸化水平增加GS 的活性来促进糖原合成，还可以通过抑制糖原磷酸化酶来达到降血糖的作用。研究［20-21］发现，过量的ROS 会促进下游GSK-3β分子通路信号表达，同时GSK-3β 也可以刺激机体产生氧化应激。本研究结果显示，与模型组相比，肝糖异方组可使p-GSK-3β/GSK-3β蛋白的表达显著升高，提示肝糖异方可能具有通过促进GSK-3β 磷酸化，减轻氧化应激从而起到影响肝细胞内糖原合成的作用。
FoxO1作为糖异生信号通路的一个重要信号分子，贯穿细胞核内外，在细胞的增殖、凋亡、分化和抵抗氧化应激等方面发挥重要作用。大量研究［22-23］表明，FoxO1 在肝脏糖脂代谢中具有重要的调控作用；
其受上游磷脂酰肌醇3 激酶/Akt 信号转导通路（PI3K/Akt）的调控，被Akt 磷酸化后出细胞核失去活性，影响下游靶基因葡萄糖-6-磷酸酶及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达，从而抑制肝脏糖异生过程，达到降低血糖的作用。研究［24］表明，通过抑制FoxO1 蛋白活性可以增强细胞抗氧化能力，抑制氧化应激产生。本研究发现，与模型组相比，肝糖异方使p-FoxO1/FoxO1 的表达显著升高，提示肝糖异方可能具有通过促进FoxO1 磷酸化提高抗氧化能力，从而达到调控糖异生的作用。
综上所述，肝糖异方具有较好的改善肝细胞损伤及抗氧化作用，且其改善糖代谢的作用机制可能与影响GSK-3β/FoxO1 磷酸化的糖原合成通路有关，其确切的作用机制有待于进一步深入研究。
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