孙利军，周佳婧，韩笑，唐义舜，奎秋宇，徐松芝，朱素琴*，顾海鹰*
（1.南通大学 生命科学学院，江苏 南通 226019；
2.南通大学 公共卫生学院，江苏 南通 226019）
植物在生长发育过程中经常受到干旱、高盐、病原菌等非生物和生物胁迫的影响。通常，这些外界的负面影响会引起植物内在细胞的损伤和植物外表的改变，从而破坏植物生长的规律和影响作物产量[1]。在长期的进化过程中，植物形成了一系列的防御机制来适应和抵抗各种外界条件胁迫[2]。在众多的机制中，以基因表达的转录调控作用最为明显，并且在植物的抗逆响应中起着重要作用。
NAC 转录因子是植物中最大且特有的一个转录因子家族[1，3-5]。生物信息学分析表明，水稻基因组中有149 个成员，拟南芥有117 个，烟草和大豆有152 个成员[6-9]。NAC 家族已被发现在植物各个过程包括功能叶片衰老[10-11]、细胞壁的形成[12-13]等方面发挥着重要的作用。在多种生物和非生物胁迫响应中，NAC 转录因子同样也起着至关重要的作用[14-15]。
NAC 基因家族的功能鉴定和分析研究目前主要集中在拟南芥和水稻[14-15]，番茄中大多数成员的生物学功能仍然未知。研究发现，番茄SLNAC1、SLNAC3、SLNAM1 等转录因子有参与番茄抗逆反应功能[16-17]。在前期研究中，我们利用植物转录因子数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php）和SOL数据库（http://solgenomics.net/）鉴定了番茄NAC 转录因子，并对NAC 保守结构域进行分析，共获得了101 个NAC 保守结构域，分析了氨基酸序列及其氨基酸长度，cDNA 的分子量、等电点，不稳定指数，脂肪族氨基酸指数，总平均亲水性等[18]。在此基础上，我们初步鉴定了8 个番茄NAC 基因可能与植物所参与的渗透胁迫和衰老有关，24 个番茄NAC 基因可能与发育相关，20 个番茄NAC 基因可能与植物抗逆相关，并命名为Stress-SLNAC（SSLNAC）[18]。本研究将对鉴定的20 个SSLNACs 基因对不同非生物胁迫的表达模式进行分析，旨在为番茄NAC 转录因子家族抗逆基因功能的进一步分析提供信息基础，为番茄抗逆品种的选育提供候选基因。
1.1 植物生长
番茄品种选择苏红2003。将番茄种子散布于湿润滤纸上，25 ℃培养2～3 d，待发芽后转移至跖石、泥炭土、珍珠岩（体积比6∶2∶1）的混合基质中，培养温度为20～25 °C，光照强度为30 000 lux，光照14 h/黑暗10 h。
1.2 非生物胁迫处理
4 周龄番茄幼苗用于干旱、高盐和低温处理。干旱处理：对正常生长的番茄幼苗停止浇水，使其自然失水，根据番茄幼苗的干旱程度，分别于第3 天（轻度干旱，番茄生长状态良好）、第6 天（中度干旱，番茄部分叶片开始萎蔫）和第9 天（重度干旱，番茄大部分叶片萎蔫）采集番茄叶片备用。高盐处理：对叶片喷施200 mmol/L 的NaCl，使幼苗叶片上充满了微小的液滴，分别在3，6 和12 h 采集番茄叶片备用。低温处理：将番茄置于4 °C 的冰箱，分别在3，6 和12 h 采集番茄叶片备用。不经任何处理的番茄叶片作为对照组。采集不同时间的番茄叶片样品，液氮冷却后-70 °C 下保存备用。
1.3 RNA 提取
番茄叶片总RNA 的提取主要采用RNAiso 法。将0.2 g 冰冻叶片磨成粉末，放入1.5 mL 离心管中，在离心管中加入1 mL RNAiso，盖上管盖，剧烈振荡15 s，然后将其放置在室温下10 min，4 ℃12 000 g离心10 min，取溶液于新的离心管加200 μL 氯仿，剧烈振荡15 s，放置在室温下10 min，4 ℃12 000 g离心10 min，取上层水相加入新离心管重复上一步，之后再次取上层水相加入新的离心管，加异丙醇至0.5 mL，室温下放置10 min，4 ℃12 000 g 离心10 min，收集RNA 沉淀。用0.5 mL 质量分数为75%的酒精洗涤沉淀，振荡，4 ℃7 500 g 离心5 min，室温下放置5 min 进行干燥，之后加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA 沉淀，-70 °C 下保存备用。
1.4 cDNA 合成
第一链cDNA 合成试剂盒由AMV Reverse kit（Takara）、0.25 mL PCR 管组成，反应体系为20 μL，依次加入1 μL Oligo（dT）18 primer、10 μL 2 ×TS反应混合、1 μL Trans Scipt RT/RI Enzyme、2 μL RNA、RNase-free 水至20 μL 混合均匀。反应过程为：30 ℃10 min、50 ℃30 min、95 ℃5 min、5 ℃5 min，将新合成的c-DNA 链-20 ℃下保存备用。
1.5 实时定量PCR
为了研究胁迫相关SSLNACs 基因在不同非生物胁迫下的表达，设计了20 个SSLNACs 基因的引物，并以β-actin 基因为内参[17]。所用的实时定量引物序列详见表1。qRT 采用PCR 仪cfx96 系统进行，采用20 μL 反应体系，包含1 μLcDNA 模板、10 μL TransStart Tip green qPCR super mix、PCR 正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。反应程序为95 ℃预变性10 min、60 ℃15 s、72 ℃延伸40 s，40 个循环后使用溶解曲线进行分析，采用公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量。
表1 番茄胁迫相关SSLNACs 基因的实时定量引物Tab.1 The qRT-PCR primers of SSLNAC genes
1.6 方差分析
实验设置了对照组和处理组，每组处理3 株，3次生物学重复。采用的RNA 样品来自于3 个生物重复，每一个生物重复来自两株番茄叶位相同的两片叶片，技术重复3 次。处理间的显著性差异分析采用SPSS 软件的t 检验进行统计分析。
2.1 SSLNACs 基因对干旱胁迫的响应
研究了不同的干旱时间下，干旱胁迫对SSLNACs 基因表达的影响（图1）。与对照组相比，SSLNAC1、SSLNAC4、SSLNAC5、SSLNAC6、SSLNAC8、SSLNAC9、SSLNAC13、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC17、SSLNAC18、SSLNAC19、和SSLNAC20 上调表达超过3 倍，表达差异达到极显著水平。其中，SSLNAC1、SSLNAC5、SSLNAC8、SSLNAC9、SSLNAC13、SSLNAC14 和SSLNAC17 在轻度干旱的条件下，就表现出较高的表达水平。
图1 SSLNACs 在干旱胁迫下的表达模式Fig.1 The expression pattern of the SSLNAC genes under the drought stress
2.2 SSLNACs 基因对高盐胁迫的响应
用0.15 mol/L NaCl 溶液喷施番茄叶片后，分别在3，6 和12 h 进行表达研究，结果如图2 所示。与对照组相比，SSLNAC1、SSLNAC2、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC9、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC16、SSLNAC17 和SSLNAC20 上调表达超过3 倍，表达差异达到极显著水平，且这些基因对高盐处理较为敏感，表达量在3 h 就可以达到高峰。
图2 SSLNACs 在高盐胁迫下的表达模式Fig.2 The expression pattern of the SSLNAC genes under the high salinity stress
2.3 SSLNACs 基因对低温胁迫的响应
对番茄进行低温处理，分别在3，6 和12 h 进行表达研究，结果如图3 所示。与对照组相比，SSLNAC1、SSLNAC2、SSLNAC3、SSLNAC4、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC8、SSLNAC9、SSLNAC11、SSLNAC12、SSLNAC13、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC16、SSLNAC17、SSLNAC18 和SSLNAC20 上调表达超过3 倍，表达差异达到极显著水平。
图3 SSLNACs 在低温下的表达特性Fig.3 The expression pattern of the SSLNAC genes under the cold stress
2.4 SSLNACs 重叠表达特性研究
研究发现，SSLNAC1、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC9、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC17 和SSLNAC20 基因对干旱、高盐和低温的胁迫都有响应。SSLNAC4、SSLNAC8、SSLNAC13 和SSLNAC18对干旱和低温胁迫都有响应，SSLNAC2 对高盐和低温胁迫都有响应。
基因的差异表达与其生物学功能有着紧密的联系。如我们前期利用水稻基因芯片数据库，分析了水稻OsNACs 家族基因在高盐、干旱、低温胁迫后的表达水平，发现有50，45 和44 个OsNACs 基因分别对干旱、高盐以及低温胁迫作出响应[9]。在这些水稻胁迫响应基因中，SNAC1、SLNAC2（OSNAC6）、OsNAC5、OsNAC10（ONAC122）或OsNAC045的转基因过量表达体，显著增强了水稻对干旱、高盐的耐受性[19-23]。此外，过表达水稻OsNAC6 基因，可以增强植物对真菌病害稻瘟病菌的抗性[20]。应用病毒诱导基因沉默（VIGS）系统证实了ONAC122 和ONAC131 基因在水稻抗稻瘟菌中的正向调控作用[24]。Jiang等[25]分析了拟南芥NAC 家族基因对盐胁迫的响应，从盐胁迫处理后的拟南芥根部组织中发现33 个NAC 基因的表达发生改变。在ANAC019、ANAC055、ANAC072/RD26 或ATAF1的转基因过量表达体中，增加了拟南芥对干旱的耐受性[26-27]。拟南芥中ATAF1 和ATAF2 基因已被证明是针对不同病原体防御反应的负调节因子[27-28]。在本研究中，鉴定的20 个与逆境相关的番茄SSLNACs 基因中，13个SSLNACs 基因可以被干旱胁迫诱导表达，10个SSLNACs 基因可以被高盐诱导表达，17 个SSLNACs 基因可以被低温诱导表达，预示其在应对不同的非生物胁迫中具有重要的生物学功能。更为重要的是，SSLNAC1、SSLNAC6、SSLNAC7、SSLNAC9、SSLNAC14、SSLNAC15、SSLNAC17 和SSLNAC20 基因的表达可以被干旱、高盐和低温胁迫所诱导，表现出重叠的表达特性，这种重叠表达的特性预示其在不同非生物胁迫中的功能多效性。
尽管NAC转录因子在不同逆境胁迫中发挥了重要作用，但作为一个大的转录因子家族，只有少数几个NAC 转录因子的作用是清晰的，大多数NAC 转录因子在植物抗逆机制中的功能，仍需要进一步探讨。这也表现出NAC 转录因子在转基因育种中的广泛应用前景。我们研究了20 个与抗逆相关的SSLNACs 基因在不同非生物胁迫作用下的表达模式，结果表明，这些基因对不同的非生物逆境表现出重叠的表达特性，这种重叠的表达特性预示其在不同的非生物胁迫中的功能多效性，为进一步的功能分析提供了依据。因此，通过改变番茄抗逆相关NAC 蛋白活性以及转基因技术有可能得到新的有价值的品种和转基因番茄新材料。
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