周 震，王贞祯，魏 勇，解津刚，马忠全，彭夏雨*
（1.石河子大学动物科技学院 832003；
2.新疆天润乳业 830000；
3.新疆天润建融牧业 843015）
近年来，在国家和各级地方政府奶业振兴计划的推动下，全国奶业发展取得了可喜的成就。《2020中国奶业质量报告》显示，2019年中，我国全国奶产品产量达到3297.6万t，位于全球第四位，其中规模化奶牛场占绝对主导地位。据统计，2018年我国规模牛场数量已超过4000个，规模牛场存栏荷斯坦奶牛达550万头，占中国奶牛存栏量的76%[1]。我国奶牛养殖业虽然取得了长足的发展，但是，群体生产水平和效益与世界发达国家相比还存在一定的差距，尤其是育种方面还存在单产水平低﹑育种水平低﹑良种数量少﹑良种覆盖率低等方面的问题。奶牛生产力性状中产奶性状是最重要的经济性状，受微效多基因控制，是奶牛选育的重要方向。作为数量性状，受环境和遗传双重影响，近年来的研究表明，泌乳相关激素如催乳素﹑雌激素﹑生长激素等对产奶性状有着较大的影响[2]，而其中催乳素作为泌乳直接相关激素，其基因表达模式和分泌对产奶性状有重要作用。
催乳素是由垂体分泌的一种多肽类激素，它具有启动和维持泌乳，促进乳腺和性腺发育的功能。在牛上，催乳素基因位于23号常染色体上，长度为8616bp，编码区大小690bp，由5个外显子和4个内含子组成。其指导合成的催乳素经垂体释放入血后，与细胞膜上的特异性受体结合，激活JAK2/STAT5信号传导通路，启动泌乳[3]。周国利等[4]对奶牛PRL基因外显子3的RsaⅠ位点进行酶切分型，结合产奶性状来看可以得出，AB的产奶性状略高于AA。OĞUZKAN S B[5]研究了催乳素基因外显子3的多态性。结果发现被检测种群处于哈代－温伯格平衡状态。本研究以新疆南疆某地区中国荷斯坦奶牛为材料，采用PCR-SSCP方法对催乳素基因外显子3进行研究，并结合生产性状进行相关分析，以期为南疆地区奶牛分子标记辅助选择育种提供理论参考。
1.1 试验材料
1.1.1 血液样本的采集
选取高产（产奶量≥9000kg）﹑中产（6000kg≤产奶量＜9000kg）﹑低产（产奶量＜6000kg）奶牛共428头拥有完整产奶周期﹑2～4胎次的中国荷斯坦奶牛，其中高产253头﹑中产136头﹑低产42头，对其进行尾根静脉采血3mL，肝素钠抗凝，-20℃保存备用，同时针对上述牛只进行血清的收集，-20℃冷冻保存。
血液全基因组提取试剂盒﹑PCR-Mix预混液均购自北京天根生物股份有限公司；
引物由上海生工生物有限责任公司合成；
牛血清催乳素含量Elisa检测试剂盒购自晶美生物技术有限公司。
1.1.2 DHI生产性能的收集
收集所研究428头奶牛的近6个月DHI测定结果，并使用Excel表格进行整理和分型。
1.2 方法
1.2.1 血液全基因组DNA的提取
使用天根血液全基因组提取试剂盒进行血液总DNA的提取，并使用TE溶解至100μL，于-20℃冷冻备用。
1.2.2 引物的设计与PCR反应
参考NCBI上的牛催乳素基因序列，使用Primer 5 对牛催乳素基因外显子3进行引物的设计，引物设计如下：
F: 5’-CAAACAACCCTAAACGAAT-3’
R: 5’-GAAAACCCGGATAAAAG-3’
PCR反应体系为：上下游引物各0.4μL﹑模板1μL﹑mix 7.5μL﹑水6.2μL，共15.5μL；
反应条件：94℃变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸45s，反应设置35个循环，最后4℃保存，扩增目的片段大小为172bp。扩增产物使用2.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.3 PCR产物的变性以及非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳
取2.5μL PCR产物和8μL变性剂混合，95℃变性15min，取出后立即放入-20℃冰箱中备用。
配置8%聚丙烯酰胺凝胶（37.5:1），取37.5:1的丙烯酰胺制胶液26.6mL﹑5×TBE 20mL﹑水52.7mL﹑10%AP1.4mL﹑TEMED 150μL（以上试剂均购自上海生工生物公司），混合均匀后迅速倒入制胶板中，排除空气插上点样梳，静置1h后取上一步的PCR变形产物10μL点样，于120V电压电泳12h后，经固定染色和显影后置于灯上观察并记录，相关固定染色液以及显影液如表1所示。
表1 固定染色液配方
表2 显影液配方
1.2.4 牛血清催乳素含量的检测
按所购Elisa检测试剂盒（购自晶美生物技术有限公司）说明书的要求进行操作。
1.2.5 DNA测序与序列分析
挑选不同基因型的DNA样本送往上海派森诺生物公司进行测序，并使用DNAMAN软件针对测序结果进行比对。
1.2.6 生物信息学分析
利用表3软件对其功能进行分析：
表3 生物信息学功能分析方法表
1.2.7 关联分析
利用excel 2016表格对所收集的产奶相关形状进行整理，使用SPSS 25.0的独立样本T检验方法对其进行关联性分析。数据结果使用均值±标准差表示。对催乳素含量和产奶相关性状使用excel 2016进行多元线性回归分析，认为R2＞0.6时为高度相关，R2＜0.4时为低度相关，认为0.4≤R2≤0.6时为中度相关。
2.1 血液全基因组DNA提取
图1 血液全基因组DNA提取结果的琼脂糖凝胶电泳验证结果
所提DNA的260/280OD值均在1.8～2.0之间，且电泳结果显示样本条带明亮，可以作为PCR反应模板使用。
2.2 PCR扩增
PCR反应结束后，将产物置于2.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，扩增目的片段大小为172bp，电泳结果如图2。
图2 牛催乳素基因外显子3 PCR扩增产物电泳结果
产物纯净，无杂带，引物特异性好，扩增片段大小符合预期，可以进行下一步试验。
2.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
牛催乳素基因外显子3的PCR变性产物在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，得到1种基因型。
图3所示中，序号1-11均为由4个变性条带构成的1种基因型。
图3 PCR变性产物的非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
2.4 牛催乳素基因型外显子3的序列分析
经PCR-sscp试验验证，只得到1种基因型，将所得的PCR产物送往上海派森诺生物公司进行测序，并使用DNAMAN以及Chromas软件针对测序结果进行比对，结果如图4。
图4 各分组的基因测序套峰图
如图4所示，高产组﹑中产组以及低产组的测序结果显示，在78bp处均为T，没有发生碱基的突变。
2.5 生物信息学分析
使用在线网站Expasy中的Protparam以及ProtScale功能对其进行理化性质和蛋白亲疏水性的分析，分析结果如图5：
图5 亲疏水性分析结果
PRL蛋白的分子式为C1134H1805N313O343S15，其相对分子量大小为25792.6，理论等电点为5.98，由229个氨基酸组成，带负电荷的残基总数（Asp + Glu）有27个，带正电荷的残基总数（Arg + Lys）有23个。图5的亲疏水性分析结果显示，在第100个氨基酸的位置，其疏水性最强，在第110个氨基酸前后亲水性达到最高。
2.6 产奶相关性状关联性分析
2.6.1 各分组产奶相关形状的关联分析
将所得数据进行整理汇总如表4：
表4 各组产奶相关性状及其关联分析结果
在产奶量方面，高产组和中产组相比较差异极显著（P＜0.01），高产组和低产组相比差异极显著（P＜0.01），中产组和低产组相比差异极显著（P＜0.01）；
但是在乳脂率和乳蛋白率方面相比，则结果均显示差异不显著（P＞0.05）。
2.6.2 催乳素含量与产奶相关性状的相关性分析
由表5可以得出，当泌乳90d时，催乳素的含量与产奶量﹑乳脂率﹑乳蛋白率的相关性均较低；
当泌乳210d时，催乳素的含量与产奶量呈现中度相关（R2=0.4244），而与乳脂率和乳蛋白率的相关性较低。
表5 不同泌乳天数的催乳素含量与产奶相关性状的相关性分析表（R2）
2.6.3 组催乳素含量的关联性分析
表6 各组催乳素含量关联分析表 mIU/L
在针对催乳素含量的比较中，在泌乳90d时，高产组和中产组比较差异不显著（P>0.05），高产组和低产组比较差异极显著（P＜0.01），中产组和低产组比较差异显著（P<0.05）；
而在泌乳210d时，高产组和中产组相比较差异极显著（P＜0.01）。
大量研究结果表明，牛催乳素基因多态性与产奶性状有关。BRYM[6]用PCR-SSCP和测序方法在牛催乳素远端启动子区发现了一个新的单核苷酸多态性。结果表明，AA基因型牛垂体催乳素基因表达水平高于GG基因型牛。在对外显子2的研究中，刘瑞鑫等[7]对44头娟姗牛的PRL外显子2和外显子4进行研究。发现基因型组合A2G2A4A4的个体的产奶性状优于其他3种基因型组合的个体，差异显著（P＜0.05）。这表明了在娟姗牛群体中催乳素基因的突变与产奶性状具有关联性。
在外显子3的多态性的研究中，周国利等[4]对奶牛PRL基因外显子3的RsaⅠ位点进行酶切分型，结合产奶性状来看可以得出，AB的产奶性状略高于AA。OĞUZKAN S B[5]研究了催乳素基因外显子3的多态性。结果发现被检测种群处于哈代-温伯格平衡状态，Singh等[8]研究了PRL内含子3和β-球蛋白基因的外显子4和内含子4之间的跨越区域，发现Frieswal奶牛PRL的AA基因型频率高于AB和BB。PRL中的AA和BB基因型以及BLG中的AB和BB基因型可能更适合于提高产奶量。在本研究中，PRL基因外显子3不存在多态性，只存在1种基因型，可能是由于选择进行试验的南疆该地区相对封闭，在引入冻精进行改良时，父系的选择较少，引起外显子3的遗传较为稳定，其变异较少，此外，试验所选择牧场低产牛由于淘汰的原因，在本研究中选择数量较少，使得群体选择有误差，后续研究需要扩大选择群体范围，增加分析数量，对研究结果进行进一步证实。
在本研究中，催乳素的分泌量与产奶相关性状相关度均不强并且在对外显子3进行分型中只得到了1种基因型，但是催乳素的分泌量以及泌乳量仍存在较大差异，这表明其控制泌乳的基因的表达存在着不同的差异。
在外显子4和外显子5的研究中，王丽娟等[9]对第4外显子8398位点进行分析，结合生产数据发现，在泌乳Ⅱ期AG基因型的产奶量极显著高于GG基因型，但是在乳蛋白率和线性评分方面，则是GG基因型显著高于AG基因型。李峥等[3]研究了荷斯坦奶牛催乳素基因5′侧翼区调控序列，结果显示，在该序列的906位点处存在突变，该位点多态对荷斯坦牛的产奶量以及乳脂率均有影响。李吉涛[10]对牛催乳素的5调控区针对乳蛋白率进行了分析，AA与BB相对比差异极显著，这二者分别于AB基因型相比较则差异不显著。另外，在头胎牛中，并没有出现AA的基因型，推测是由于样本过少，后期可扩大样本数量进行补充。除此之外他还对催乳素基因进行了酶切分型[11]，3种基因型的产奶量均差异显著，且BB＞AB＞AA，说明了B为优势基因；
在乳蛋白率方面，基因型对其有着极显著的影响，这说明催乳素基因对奶牛产奶性状有着重要的影响。
在今后的试验中，可加大样本的采集检测数量，并逐渐增加检测的位点，可选择多种方法进行检测，并结合产奶相关性状进行关联性分析，确定优势基因和符合生产利益的经济基因，为分子育种提供理论依据。
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