蒋铭华， 易祥华
(1. 复旦大学附属闵行医院，上海市闵行区中心医院妇产科，上海 201100; 2. 同济大学附属同济医院病理科，上海 200065)
肿瘤的发生发展过程存在广泛的遗传变化和相关基因的功能及活动失调[1]。在癌症中发现DNA甲基化异常已有40余年，研究发现其对基因表达、基因组稳定性和肿瘤发生发展具有重要的作用。DNA甲基化检测样本易于从组织、血液、尿液、胸腹水和痰液中获得，检测方法具有灵敏度高、稳定性佳和成本低的特点，作为新型的生物标志物被广泛应用于各种恶性肿瘤的早期诊断，包括肺癌、消化道肿瘤、胶质瘤和妇科肿瘤等[2-3]。DNA甲基化结合其他临床诊断指标，在恶性肿瘤的诊断中发挥越来越重要的作用[4]。限于篇幅，本文主要就DNA甲基化的生物学特征和作用机制、检测方法以及在女性生殖系统肿瘤中的临床应用价值进行评述，以提高DNA甲基化检测对妇科肿瘤精准诊断的水平。
DNA甲基化检测已是成熟的分子病理学技术，分为检测整体基因组和特定基因位点两种。前者有变性高效液相色谱法、SssI甲基转移酶法、基于抗5mC的免疫化学法等；
后者有Southern印迹杂交法、焦磷酸测序法、重亚硫酸氢钠修饰后测序法、甲基化特异性PCR法和亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法等[10]。根据样本DNA预处理的方法不同，也可将DNA甲基化检测方式分为3类：
亲和富集预处理法、限制性酶切预处理法与亚硫酸氢盐处理法[11]。由于前两种预处理法的某些不足，通过亚硫酸氢盐预处理法进行的DNA甲基化检测与分析是目前的主流方法，常用的有甲基化特异性数字PCR(methylation specific PCR, MS-PCR)、甲基化荧光法(MethyLight)、核酸质谱、甲基化芯片等。基于PCR扩增的亚硫酸氢盐预处理法不需要昂贵的设备，方法简便易行，有基因扩增室的单位都能开展。
3.1 泛癌种早筛检测
液体活检血液标本被证明含有肿瘤的遗传物质且可以被检测，循环肿瘤DNA(ctDNA)的基因组谱已被证明与相应肿瘤的基因组谱密切匹配，具有协助肿瘤的精准诊断价值。通过液体活检进行多癌种早期筛查和风险评估是DNA甲基化检测的重要应用领域之一。2016年1月，测序巨头Illumina公司宣布投资1亿美元成立GRAIL公司，目的是希望通过血液检测来实现癌症早期筛查。GRAIL投入重金先后进行4项大型临床研究，重点关注肿瘤早期筛查，分别为CCGA、STRIVE、SUMMIT、PATHF-IDER。PATHFINDER计划(NCT04241796)是2019年12月启动，此项目为前瞻性干预临床试验，招募受试者大约6 200例，均为尚未诊断为肿瘤的50岁以上高危人群，通过比较其多癌种早筛产品Galleri检测结果和金标准检测结果，来评估Galleri产品在真实的癌症早筛场景中的检测性能。从上述的研究中GRAIL积累了庞大的样本数据库，建立和持续优化检测标准和算法。大样本和长周期的前瞻性研究为其癌症早筛产品提供了真实世界的研究评估数据。GRAIL公司在2021年美国临床肿瘤年会(American Society of Clinical Oncology, ASCO)年度大会上公布了其用于多癌种早筛产品Galleri首批临床数据(PATH-FINDER计划)。Galleri是一项基于血液cfDNA靶向甲基化检测的分析方法，可检测、区分临床分期的50多种癌症类型,检测多种癌症的同时可识别其起源的组织。在5 000多例的检测样本中，Galleri的总体检测灵敏度为51.5%。随着癌症患者临床分期的升级Galleri的灵敏度也稳步提升，其 Ⅰ 期患者检测灵敏度为17%，Ⅱ期为40%，Ⅲ期为77%，Ⅳ期为90%，其检测的特异性最终达到99.4%。此外，Galleri对于癌症的组织溯源定位非常的精准，可达到88.7%的准确性[12]。目前，Galleri已被美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准为“突破性设备”。虽然该测试还未获得FDA全面批准上市，但多个地区已准予该测试在50多家医院和1 100 余家诊断机构使用。
3.2 特定癌种检测
DNA甲基化具有组织的特异性，这是异常甲基化基因检测能助力肿瘤诊断的基础，也是精准诊断的需要。目前已经用于临床的血Spetin9基因甲基化检测，具有较高的灵敏度和特异度，可辅助结直肠癌的诊断。乳腺癌患者中RASSF1A、SOX17、p16、CDH1、CyclinD2和RARβ2基因启动子区域都存在高甲基化状态。p16基因启动子区域的甲基化检测可作为胰腺癌早期筛查的潜在标志物[13]。通过特定癌种开发的cfDNA/ctDNA的异常甲基化检测有望在肿瘤的精准诊断和个体化治疗中发挥越来越重要的作用。
截止2021年12月31日，获得中国国家药品监督管理局试剂盒注册证的基因甲基化产品共有9个，其中包含1个胶质瘤的MGMT基因甲基化检测试剂、1个肺癌SHOX2与RASSF1A基因甲基化检测试剂、1个胃癌血液RNF180与Septin9基因甲基化检测试剂、3个结直肠癌血液Septin9基因甲基化检测试剂、2个结直肠癌粪便SDC2基因和1个结直肠癌粪便FIT-DNA多靶点检测试剂盒。此外，在肝癌、食管癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等亦在临床验证阶段，临床的应用指日可待。
3.3 在女性生殖系统肿瘤诊断中的应用
3.3.3 宫颈癌甲基化基因检测 宫颈癌DNA甲基化基因是妇科肿瘤研究最成熟的生物标志物，目前应用最多的基因包括POU4F3、PAX1、JAM3、C13ORF18、TERT、ANKRD18CP、CDH6、GFRA1、ASTN1、DLX1、ITG4、RXFP3、SOX17、ZNF671、LHX8、PCDHA4、PCDHA13、SOX1和ZNF582，以及多基因组合的PAX1/JAM3、FAM19A4/miR124-2、CADM1/MAL/miR124-2、与体基因联合人类乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)甲基化的EPB41L3+HPV(HPV16L1、HPV16L2、HPV18L2、HPV31L1和HPV33L2)等，在宫颈刮取细胞检测皆有80%以上准确性[32-33]。双基因可达到更佳临床结果与成本控制等转化优点，更多的基因由于临床判读复杂性与通路信号重迭等因素，其临床效果需更多证据；
在HPV相关研究中发现，当PAX1/ZNF582联合HPV16/18检测可将阴道镜检查的患者数量减少31.3%，从而在阴道镜检查不易获得的地区提供可行的随访解决方案[34-35]。此外，连接黏附分子3(JAM3)通过细胞间的黏附及相互作用，调节肿瘤细胞生长，能够显著提高特异度和阳性预测值，在临床中验证EPB41L3/JAM3甲基化与高危型HPV(hrHPV)检测具有相似的阳性预测值(分别为0.930和0.954，P=0.395)并显著高于单独的细胞学检查，其可用于与HPV联合筛查或分流HPV阳性患者[36]。PAX1/ZNF582与PAX1/JAM3甲基化与HPV16/18联合检测可作为进一步阴道镜检查的参考，提高宫颈病变筛查的准确性并避免反复阴道镜检查与妇女罹癌恐慌。例如，对于hrHPV阳性患者，如果甲基化阴性，可以随访暂时不做阴道镜活检，反之要及时行病理学检查明确瘤变的存在。概括甲基化检测在宫颈病变的临床应用主要是[34-39]：
(1) hrHPV阳性患者进一步检查的分流；
(2) 对ASC-US/鳞状上皮低级别病变(low-grade squamous intraepithelia, LSIL)细胞学检查的患者进行CIN3阳性分流；
(3) hrHPV阳性育龄妇女的管理；
(4) 停经后妇女筛查避免宫颈萎缩的漏诊管理；
(5) 退出筛查计划女性的退出测试等。DNA甲基化对于检出HSIL阳性有潜在作用，与HPV检测的内容不同，联合检测可以提高液基细胞学诊断的水平，对宫颈瘤变和宫颈癌的精准诊断具有重要的临床意义。
在过去的十余年中，基于DNA甲基化的生物标志物在临床的开发和应用取得了长足的进步，在早期诊断、预后评估和疗效监测等方面显示出良好的应用前景。DNA甲基化协助肺癌、结肠癌和胶质瘤的诊断已经用于临床；
肝癌、食管癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等亦在临床验证阶段，作为一种肿瘤无创诊断的新方法受到欢迎。尽管如此，在DNA甲基化的研究和临床转化、尤其是在妇科肿瘤方面需要进一步加强。针对存在的问题和不足，未来研究的重点是：
具有肿瘤组织特异性的DNA甲基化基因的筛选，多甲基化基因的组合检测和提高检测的灵敏度，微创样本和血液ctDNA甲基化检测的开发使用，临床与病理多学科参与的甲基化检测临床转化试验等。血浆ctDNA甲基化单倍型分型技术方兴未艾，是一种用于肿瘤早筛和组织溯源、连续监测肿瘤进展和多器官转移的有效技术。毋庸置疑，DNA甲基化检测将在助力肿瘤的精准诊断和个体化治疗上发挥越来越大的作用。