孙浚源，张煜宸，王连雷，王协彬，刘新宇
钛合金具有良好的生物相容性、耐腐蚀性及抗疲劳性，在骨科疾病的诊断、治疗等方面应用广泛，已经成为骨科领域最为常用的金属材料之一[1]。但作为骨科常用的植入物材料，钛合金仍存在诸多不足，如弹性模量过高，容易产生应力屏蔽效应，生物力学性能曲线与骨骼相差较大，表面耐磨性能较差，且Ti6Al4V 等传统钛合金中所含的铝、钒等元素对人体存在着潜在的危害性[2-3]。因此，仍需开发与人体骨骼生物力学性能更为相似，且具备低细胞毒性与良好的生物相容性的生物应用材料以满足临床应用需求。
镍钛（NiTi）合金表现有形状记忆效应和超弹性，在合适的外界刺激下可以恢复其预设的形状，是集感知（温度、载荷、应变）与驱动（输出力与变形）于一体的智能材料。NiTi 合金还表现有良好的生物相容性、低弹性模量（25～90 GPa）、优良的力学性能、应力-应变特性与人体骨骼类似等特点，是一种极具应用前景的骨植入材料[4-6]。目前已研发出以NiTi 合金为材料的骨科植入物，如应用于脊柱外科的NiTi 椎间融合器[7]、NiTi 内固定棒[8]，应用于关节畸形矫正的NiTi 夹板等[9]。然而，NiTi 合金表现有加工硬化能力强、焊接性能差等特点，使其成形加工非常困难[10]。除此之外，医用NiTi 合金器件一般由丝、板、管等加工而成，通常结构简单、功能单一，严重限制了其作为骨植入材料的应用和推广。
增材制造或3D 打印是基于“离散-堆积”的原理，依据预先设定的三维模型，通过“分层制造-逐层累积”方式成形所需构件的一种加工技术。激光粉末床熔融（laser powder bed fusion,LPBF）作为一种增材制造技术，除了能够根据三维计算机辅助设计（computer aided design,CAD）模型直接成形复杂构件外，还能提供较高的成形精度及表面质量，是制备复杂骨植入物的理想手段[11-12]。目前，LPBF 制备的钛合金、钽金属等多孔结构已在临床有较多应用[13-15]。然而，增材制造NiTi合金植入物的研究尚在起步阶段。
本研究团队前期开展了LPBF 制备NiTi 合金的基础研究，发现LPBF 不仅能够作为一种成形工艺加工复杂NiTi 合金构件，同时也可作为一种物理化学冶金手段来调控NiTi 合金的相变温度及功能特性，使其在弹性模量、生物力学曲线等方面与人体骨骼更为相似[16]，为制备新型NiTi 合金植入体奠定了基础。然而，尽管已有研究证明NiTi 合金具备良好的生物相容性，但增材制造NiTi 合金与传统NiTi 合金具备不同显微组织及表面形貌，而目前尚缺乏对增材制造NiTi 合金生物性能的研究。因此，本研究计划对增材制造NiTi 形状记忆合金的细胞毒性、生物相容性进行研究，同时检测其对血管生成及细胞结构的影响。
1.1 材料、试剂与化学药品
CCK-8 试剂盒、Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、Actin-Tracker Green（微丝绿色荧光探针）由Beyotime（中国）提供，Matrigel matrix（基质胶）由Counting（USA）提供。胎牛血清和细胞培养试剂由Gibico（中国）提供。本研究采用由深圳微纳增材技术有限公司生产的NiTi 二元形状记忆合金球形粉末，成分为Ti-50.6at.%Ni（原子分数）。粉末粒径范围为15～53 μm，D50=33.8 μm。
1.2 3D打印NiTi形状记忆合金
利用LPBF 工艺成形NiTi 合金支架。增材制造设备为英国Renishaw 公司生产的RenAM 500E 激光粉末床熔融系统，配有500 W 光纤激光器，激光光斑直径为80 μm。为了降低成形过程中氧等杂质元素对材料性能的影响，采取如下措施：首先，对成形仓抽真空至-900 mbar（1 bar=100 kPa），然后充入高纯氩气（＞99.999%），并重复此过程3 次；
其次，在成形过程中保持成形仓中氩气压力略高于外界压力（约20 mbar）。上述措施可以保证激光开启前成形仓中氧含量低于20 ppm。
本研究设计了如图1所示的NiTi合金支架结构，整体尺寸为10.0 mm×10.0 mm×1.5 mm，点阵单元为1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 的体心立方结构（bodycentered cubic,BCC）。成形NiTi 合金支架所采用的工艺参数为：激光功率140 W，扫描速度800 mm/s，扫描间距80 μm，铺粉层厚30 μm。选用条带扫描策略，条带宽度为5 mm，层间旋转角67°。利用COXEM EM-30+扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）观察NiTi合金支架形貌。
图1 本研究设计的NiTi合金支架结构示意图
1.3 细胞培养
小鼠成骨细胞前体细胞（MC-3T3-E1 细胞）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）的培养方案按照既往研究操作[17-18]。将MC-3T3-E1 细胞种植到α-MEM 培养基（Gibco，添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素），于37℃、5% CO2的加湿培养箱中培养，每2 日传代1 次。HUVEC 种植到ECM 培养基（Gibco，添加10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素），于37℃、5% CO2的加湿培养箱中培养，每2 日传代1次。
1.4 金属浸出液及细胞用金属支架的获取
每组3 个金属样品在121℃下高压灭菌30 min。然后将每一个样品放置于盛有15 ml 细胞培养基的离心管中[19]。在37℃条件下，以240 rpm 的速度持续离心搅拌7 d[20]。提取的浸出液制备含100%、50%、10%浸出液的稀释液（选择α-MEM 完全培养基和ECM完全培养基进行稀释）。
1.5 细胞的处理方式和分组
M3T3-E1 细胞和HUVEC 随机分为4 个组：对照组（使用正常培养基），10%浸出液组（培养基为10%浸出液，90%正常培养基），50%浸出液组（培养基为50%浸出液，50%正常培养基），100%浸出液组（培养基为100%浸出液）。
1.6 细胞活力和细胞凋亡能力的评估
将指数生长期的MC3T3-E1 细胞以1×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，孵育24 h。在给定上述各种处理后，骨髓间充质干细胞孵育24 h，用于以下检测。使用CCK-8 试剂盒检测细胞毒性，同时依照下面的公式计算不同浓度金属浸出液作用下的MC3T3-E1细胞的存活率：
采用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒进行活/死细胞检测。使用荧光显微镜（Andor，英国）拍摄图像。使用Image J软件进行荧光定量分析。
1.7 细胞成血管能力的评估
将液体状态的基质胶按照每孔50 μl加入预冷的96 孔板中，放于37℃细胞孵箱30 min，待其凝固将指数生长期的HUEVC 以每孔5×103接种于96 孔板中，按照上述细胞分组加入不同的培养基，于5 h 后计算每孔生成管腔的数目。
1.8 细胞生物相容性的评估
将增材制造的NiTi 形状记忆合金细胞支架置于6 孔板中，按照每孔1×105个细胞将细胞接种于孔中共同孵育24 h、48 h 和72 h 后使用Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒进行荧光染色，观察细胞形态。
1.9 NiTi形状记忆合金对细胞结构的影响
将增材制造的NiTi 形状记忆合金细胞支架置于6 孔板中，按照每孔2×105个细胞将MC3T3-E1 细胞接种于孔中，共同孵育72 h 后使用胰酶消化液消化后按照1×105进行种板，同时将正常培养条件下的MC3T3-E1 细胞按照同样的细胞量进行种板，待二者细胞贴壁后，使用Actin-Tracker Green 进行荧光染色，使用Image J 软件与正常培养条件下的细胞Actin-Tracker Green染色进行荧光定量分析。
1.10 统计学方法
采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析细胞活力和细胞凋亡能力的实验结果和细胞成血管能力的实验评估结果；
采用t检验分析NiTi形状记忆合金对细胞结构影响的实验结果。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 NiTi形状记忆合金点阵结构
图2 给出了NiTi 合金点阵结构的SEM 图像，其中图2A-C 的观察方向与打印方向平行，即点阵结构的侧面，图2D-F 为点阵结构的顶面。图2 显示点阵单元的形状为规则的矩形，与设计的体心立方结构相符。设计的棱柱尺寸为150 μm，而通过SEM 观察，实际棱柱尺寸大于200 μm。可以观察到支架侧面黏附较多未熔NiTi 粉末（图2B），支架侧面棱柱结合处存在少量裂纹（图2C），支架的顶面吸附粉末相对较少（图2E），支架展现出明显的台阶效应（图2F）。
图2 激光粉末床熔融制备的NiTi合金点阵结构的扫描电子显微镜下图像
2.2 NiTi形状记忆合金不抑制细胞生长
CCK-8结果显示，在加入金属浸出液1 d、3 d、7 d后，不同浓度的浸泡液组与对照组比较，细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05，图3）。Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒能够使活细胞带绿色荧光，使凋亡的细胞带红色荧光。图4 所示，不同浓度的金属浸出液处理后的细胞没有明显的红色荧光，说明金属浸出液不具备生物毒性。
图3 CCK-8结果显示不同浓度金属浸出液不同处理时间下的细胞活力
图4 不同浓度金属浸出液处理下的细胞Calcein/PI染色
2.3 NiTi形状记忆合金不影响血管的生成
用于制造骨植入体的NiTi 形状记忆合金的金属浸出液对血管生成没有负面作用。不同浓度的金属浸出液处理下，血管生成未受影响，也没有出现管腔的崩解现象（图5）。各组管腔平均分支数如下：对照组57.67±4.78，10% 浸泡液组54.67±4.92，50%浸泡液组57.33±10.92，100%浸泡液组56.67±4.98。各个组间管腔平均分支数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
图5 不同浓度金属浸出液处理5 h后的血管生成光镜图
2.4 NiTi形状记忆合金的生物相容性
NiTi 形状记忆合金具有良好的细胞黏附性。将MC3T3-E1 细胞与NiTi 形状记忆合金样品共孵育后使用荧光显微镜观察细胞形态。24 h 时细胞已经开始黏附于NiTi记忆合金表面；
48 h后可见细胞已经开始长入NiTi形状记忆合金样品的孔隙；
72 h后细胞已经完全长入合金样品的孔隙，说明NiTi 形状记忆合金有很好的生物相容性，可以为成骨细胞搭建良好的生物平台（图6）。
图6 使用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒对与NiTi形状记忆合金共孵育的MC3T3-E1细胞染色
2.5 NiTi形状记忆合金可以增强细胞结构强度
细胞的结构强度主要由细胞内微丝含量决定，微丝含量越高，细胞具有越强的结构强度。金属样品组细胞的平均荧光强度为56.69%±6.95%，显著大于对照组（36.37%±6.88%，P＜0.05，图7），说明金属样品组中细胞的微丝含量大于对照组，将细胞接种于NiTi 形状记忆合金后，会获得更强的细胞结构强度。
图7 细胞Actin-Tracker Green染色荧光图
NiTi 形状记忆合金因具有优良的机械和生物性能，独特的形状记忆效应和超弹性，在生物医学领域得到了广泛的应用[21]。但因为传统的NiTi 形状记忆合金存在加工成形困难、弹性模量较人体骨骼仍较高等缺陷，在骨科领域的应用受到限制[22]。而激光增材制造技术基于CAD 数据，通过逐层累积的方法可以对NiTi 合金粉末材料进行加工，既而制造复杂的结构，为骨科植入物提供新的创新材料[23]。Bartolomeu等[24]研究发现，可将激光增材制造NiTi合金弹性模量的最小值调控至3 GPa左右，达到人体松质骨相近的弹性模量。
但目前针对增材制造NiTi 合金细胞毒性和生物相容性的研究较少，Habijan 等[25]通过细胞与金属样品共培养后活死染色的方式证明了人类间充质干细胞可以在样品上生长。本研究更为全面地通过CCK-8试剂盒与Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测了增材制造NiTi 合金的生物毒性与细胞活性，通过血管生成实验与细胞内微丝含量测定检测增材制造NiTi合金对细胞功能与结构的影响。
通过SEM 对增材制造NiTi金属支架进行观察时发现实际棱柱尺寸大于预设计棱柱尺寸，这可能是由于LPBF 过程中，熔池不断吸收周围粉末，使棱柱尺寸增加，导致实际孔隙率比设计的孔隙率低。除此之外，研究人员还观察到未熔的NiTi 粉末与裂纹的产生，这分别可能是由于处在熔池边界的粉末颗粒部分熔化，凝固后附着在支架表面，及快速冷却过程中产生较高热应力，在棱柱结合处应力集中更明显，导致裂纹产生。除此之外，本研究还观察到明显的台阶效应，这主要是由增材制造的分层加工特点引起的。表面未熔粉末、裂纹及台阶效应都会影响NiTi合金支架表面质量及镍离子析出行为，影响其生物性能。
既往研究在增材制造NiTi 合金的实验中发现镍离子的释放[25]。本研究发现增材制造NiTi 合金支架中存在未熔的NiTi 粉末颗粒，这会导致支架表面积增加，影响镍离子释放由于释放的镍离子浓度会对细胞的生长产生影响，本研究选取了不同浓度的金属浸出液，以更为全面地评估镍离子浓度的影响。
据文献报道，MC3T3-E1 细胞和HUEVC 被广泛应用于医用植入物[17-18]，本研究选取这两类细胞进行NiTi 形状记忆合金制作骨外科植入体的体外实验。CCK-8 实验测定细胞于NiTi 形状记忆性合金的生物毒性，Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性，说明增材制造的NiTi 形状记忆合金作为植入体，可以满足极低的生物毒性。
植骨的成功与否很大程度上取决于血运[26]。血管形成实验（tube formation assay）[27]是体外研究血管生成的经典方法，该方法可快速确定参与血管生成的各种因素。HUVEC 具有干细胞的潜能，理论上可以传代50～60次，因此被选用于此次实验。由实验结果可得，增材制造NiTi 形状记忆合金对血管生成没有任何负面影响，同时作为金属植入物，可以为植骨提供一个良好的生物平台。
本团队设计实验验证NiTi 形状记忆合金细胞支架可以为小鼠成骨细胞前体细胞提供一个良好的附着平台[28]，具有极高的生物相容性，同时使用微丝绿荧光探针进行标记附着与NiTi 形状记忆合金细胞支架和自由溶胀细胞的微丝后发现NiTi 形状记忆合金上消化下来的细胞具有更高的平均荧光强度，荧光强度可以反映微丝的数目，而微丝数量可以反映新生骨的强度，即微丝越多细胞的结构强度越高。
本研究采用激光增材制造技术，制备了NiTi 形状记忆合金支架，并用MC3T3-E1 细胞和HUEVC 证明了增材制造NiTi 合金具备较低的细胞毒性、良好的生物相容性，并可以通过增加细胞内微丝含量增强细胞结构。本研究较为全面地证明了增材制造NiTi 合金可以安全地在体内应用，为增材制造NiTi合金在骨科植入物中的应用提供基础。
【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突
猜你喜欢记忆合金浸出液增材石材增材制造技术研究石材(2022年4期)2022-06-15废旧电池浸出液对铜钱草危害性的研究生物学通报(2020年10期)2020-08-13形状记忆合金及其研究进展综述科学技术创新(2020年21期)2020-01-06嗜酸氧化亚铁硫杆菌脱除废手机PCB表面元器件的方法研究中国环境科学(2019年10期)2019-10-23激光增材制造仿真过程分析制造技术与机床(2019年6期)2019-06-25走进记忆合金中学生数理化·八年级物理人教版(2019年12期)2019-05-21我国增材制造技术的应用方向及未来发展趋势表面工程与再制造(2019年1期)2019-05-11保温材料浸出液成分及腐蚀性分析天然气与石油(2018年5期)2018-11-06焊接增材制造研究新进展焊接(2016年4期)2016-02-27富铼渣双氧水浸出液铼钼分离工艺研究中国资源综合利用(2016年6期)2016-01-22