程佳琪 郭红光 张子中
(1.太原理工大学安全与应急管理工程学院，030024 太原；
2.太原理工大学原位改性采矿教育部重点实验室，030024 太原)
煤层气的开采不仅可以增加能源供应量，还可以减少温室气体排放量[1]。我国煤层气储量大，但是大多数煤层气井单井产量低且不产气时间长，导致煤层气产率低下[2]，限制煤层气产业的发展。煤层气生物工程能够利用厌氧微生物降解煤产甲烷的特性来实现生物甲烷产量的增加[3]，具有显著的经济效益和广阔的应用前景。然而，直接以煤为底物进行厌氧生物降解的甲烷产量较低[4]。为此，国内外学者提出了一系列方法以增强煤的厌氧生物降解效率，提高甲烷产量。其中，煤与秸秆共降解增产甲烷效果显著。YOON et al[5]发现，添加水稻秸秆可以促进褐煤产甲烷。李亚平等[6]研究证实，与煤和水稻秸秆单独降解相比，水稻秸秆与不同煤阶煤共降解甲烷产量均有提高，且共降解甲烷产量远高于煤和秸秆单独降解甲烷产量之和。GUO et al[7-9]的研究结果显示，添加玉米秸秆可以促进共降解体系中优势微生物群落互补和代谢相关酶的表达，从而显著提高生物甲烷产量。此外，水稻秸秆的部位和粒径都影响其对无烟煤生物甲烷的增产效果[10]。煤与秸秆共降解不仅显著提高生物甲烷产量、增产煤层气，而且能够实现秸秆的资源化利用。我国农作物秸秆可收集利用量巨大[11]，廉价且易获得，有助于共降解增产煤层气的实施。同时，我国褐煤资源储量丰富，利用厌氧微生物帮助其生产生物甲烷也有利于褐煤资源的高效清洁利用[12]。
为进一步明晰煤与秸秆共降解增产甲烷机制，选取生物更易利用的褐煤和水稻秸秆为研究对象，研究了共降解作用后微生物群落结构、有机物组成、煤与秸秆结构的变化规律，并将共降解与单独降解进行对比，明确共降解增产甲烷的独特作用，为进一步提高甲烷产量、促进煤层气生物工程应用提供参考，助力煤层气产业可持续发展。
1.1 实验材料
实验用褐煤取自内蒙古呼伦贝尔，使用前用粉碎机将其粉碎，筛分后选取粒径范围为0.125 mm～0.150 mm的样品，并在干燥箱中105 ℃下干燥6 h，然后装入自封袋中保存。煤样的工业分析和元素分析分别按照GB/T 212-2008和GB/T 31391-2015中的方法进行测定，结果如表1所示。实验用水稻秸秆来自江苏省沭阳县，手工挑选出茎杆部分，将其剪切为5 mm，在55 ℃下干燥6 h，装入自封袋密封保存。实验用菌群富集自沁水盆地南部煤层气井采出水，以褐煤为唯一碳源进行多次转接培养，获得稳定产甲烷微生物菌群。
表1 褐煤的工业分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analyses of lignite
1.2 褐煤与水稻秸秆共降解产甲烷实验
实验所用培养基包括基础培养基、半胱氨酸-硫化钠溶液、维生素溶液和微量元素溶液[6]。1 g煤和0.3 g的水稻秸秆以及菌群接种物、培养基、灭菌水共同构成30 mL的反应体系，将其放于140 mL的厌氧瓶反应器中进行共降解，然后将厌氧瓶放置于35 ℃恒温箱中进行厌氧培养。分别以1 g煤和0.3 g秸秆单独降解作为对照组。每组实验均设置三组平行实验。利用上海海欣公司生产的气相色谱仪(GC-950)每隔7 d定期检测各组厌氧瓶中甲烷生成情况，最后取三组平行实验的均值作为实验甲烷产量，并使用标准差绘制误差线。
基础培养基、半胱氨酸-硫化钠溶液、维生素溶液和微量元素溶液中各物质的密度如下。
基础培养基：11.00 g/L NaCl，3.450 g/L MgSO4·7H2O，2.750 g/L MgCl2·2H2O，0.335 g/L KCl，0.250 g/L NH4Cl，0.140 g/L CaCl2·2H2O，0.140 g/L K2HPO4，1.00 g/L酵母提取物。半胱氨酸-硫化钠溶液：25.00 g/L半胱氨酸，25.00 g/L Na2S。维生素溶液：0.50 mg/L维生素B1，0.50 mg/L维生素B2，0.50 mg/L维生素B3，1.00 mg/L维生素B6，0.20 mg/L维生素B7，0.01 mg/L维生素B12，0.50 mg/L硫辛酸，0.20 mg/L喋酰谷氨酸，0.50 mg/L4-氨基苯甲酸。微量元素溶液：19.00 mg/L CoCl2·6H2O，10.00 mg/L MnCl2·4H2O，7.00 mg/L ZnCl2，3.60 mg/L硼酸，2.40 mg/L NiCl2·6H2O，1.00 mg/L KAl(SO4)2，0.60 mg/L钼酸钠，0.20 mg/L CuCl2，0.15 mg/L FeCl2·4H2O，体积分数为25% HCl溶液10.00 mL。
1.3 高通量测序
产甲烷结束后，培养液用0.22 μm滤膜(美国Millipore公司生产)过滤。采用UltraClean○RSoil DNA Isolation Kit(美国Mobio公司生产)提取滤膜上的微生物DNA。采用细菌特异性引物515F-907R[13]和古菌特异性引物519F-915R[14]对提取DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美国Axygen公司生产)纯化PCR产物。将提取的DNA在高通量测序仪Illumina Miseq(美国Illumina公司生产)平台进行测序。测序完成后，过滤掉低质量序列，然后在97%的相似性水平下，对剩余序列进行操作分类单元(OTUs)聚类。最后从每一个OTU中选择一条代表序列与Silva数据库进行比对，得到该OTU 的分类信息。
1.4 GC-MS检测
实验结束后，取20 mL培养液过滤，得到的滤液分别在中性、酸性、碱性的环境下用CH2Cl2萃取三次，所有萃取液混合后加入过量无水硫酸钠密封于4 ℃条件下静置12 h。静置后的液体经过旋转蒸发、氮吹，浓缩至2 mL，通过气Agilent 7890B/5977B相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司生产)对液体中有机物成分进行测定。载气为体积分数为99.999%的氦气，流速为30 mL/min。升温程序为：初始温度60 ℃条件下保持3 min，温度先以20 ℃/min的升温速率升至150 ℃，然后再以5 ℃/min的升温速率升高至230 ℃，保持5 min。根据美国国家标准与技术研究院数据库(NIST 14L)对检测到的化合物进行鉴定比对。
1.5 XRD测定
采用SmartLab型X射线衍射仪(日本理学公司生产)对原秸秆、单独降解后秸秆和共降解后秸秆的结构进行测定。在工作电压为45 kV和工作电流为100 mA下，采集铜和钾辐射的秸秆样品的XRD数据，扫描范围为5°～90°，扫描步距为0.05°，扫描速率为6 °/min。通过XRD谱分析秸秆降解产生物甲烷前后其纤维素结晶度的变化。秸秆样品的结晶度指数(CrI)计算如公式(1)所示[15]。
CrI=[(I002-Iamorphous)/I002]×100%
(1)
式中：CrI为结晶度指数，%；
I002为002晶格面的最大衍射强度；
Iamorphous为2θ=18°时背景峰的强度。
1.6 13C-NMR测定
采用AVANCE Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司生产)对原煤、单独降解后煤和共降解后煤进行检测。配备H/X双共振固体探头，4 mm ZrO2转子，转速为10 kHz。共振频率为100.625 MHz，采样时间为6.25 μs，谱宽为30 kHz，循环延迟时间为15 μs，扫描次数为1 024次。采用MestReNova软件对煤的13C-NMR谱中各官能团的化学位移区间进行积分。
2.1 褐煤与水稻秸秆共降解产甲烷效果分析
褐煤与水稻秸秆共降解、褐煤单独降解、水稻秸秆单独降解的甲烷产量如图1所示。由图1可知，水稻秸秆单独降解的甲烷产量最少，最大产量仅为17.3 μmol。褐煤单独降解前7天甲烷产量快速增长，在第14天甲烷产量达到最大，为162.11 μmol。煤与水稻秸杆共降解的甲烷产量在第21天达到最大，为388.47 μmol，比褐煤单独降解的甲烷产量增长了139.63%，比褐煤单独降解的甲烷产量和秸秆单独降解的甲烷产量之和增长了116.53%。由于纤维素是植物细胞壁的主要成分，在其周围充填着半纤维素和木质素，结构复杂，不利于其降解产生甲烷[16]。因此，秸秆单独降解的甲烷产量极低。褐煤与水稻秸杆共降解的甲烷产量比褐煤和秸秆单独降解的甲烷产量之和还要多，说明褐煤与水稻秸秆共降解促进了二者的降解，导致了甲烷的增产[6]。
图1 褐煤与水稻秸秆共降解和单独降解的甲烷产量Fig.1 Methane production from co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw
2.2 微生物群落结构分析
2.2.1 细菌群落结构分析
褐煤与水稻秸杆共降解、褐煤单独降解、水稻秸杆单独降解后降解液中细菌群落结构如图2所示。由图2可知，降解液中细菌群落随底物不同而差异显著，说明底物对降解液中微生物群落结构起着决定作用。在共降解液中相对丰度最大的细菌群落为梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和长杆菌科(Prolixibacteraceae)，相对丰度分别为45.76%和22.07%。褐煤单独降解的降解液中相对丰度最大的细菌为Prolixibacteraceae，其相对丰度为27.91%，其次为沉积杆菌属(Sedimentibacter)，其相对丰度为19.96%，Clostridium的相对丰度为3.89%。秸秆单独降解的降解液中优势细菌群落分别为Prolixibacteraceae和Clostridium，相对丰度分别为21.92%和18.51%。Prolixibacteraceae在三种降解液中相对丰度差别不大，它是厌氧消化产甲烷过程中常见发酵微生物，可将多糖等物质降解成乙酸[17]。而Clostridium的相对丰度变化显著，在共降解液中其相对丰度明显增大。Clostridium能够分泌纤维素酶降解纤维素[18]，也可以直接参与纤维素降解[19]。此外，共降解液中还检测到多种纤维素降解菌，如副梭菌属(Paraclostridium)[20]。Paraclostridium在共降解液中的相对丰度比在褐煤单独降解的降解液和水稻秸秆单独降解的降解液中的相对丰度均增加了两倍多。因此，褐煤与水稻秸秆共降解使细菌群落结构发生变化，尤其是提高了Clostridium和Paraclostridium等纤维素降解菌的相对丰度，从而促进秸秆中纤维素和煤中纤维素衍生物的降解，增大甲烷产量。
图2 褐煤与水稻秸秆共降解和单独降解后降解液中细菌群落结构Fig.2 Bacterial community structure of degradation solution after co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw
2.2.2 古菌群落结构分析
褐煤与水稻秸杆共降解、褐煤单独降解、水稻秸杆单独降解后降解液中古菌的群落组成如图3所示。由图3可知，甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)为主要的产甲烷菌，在褐煤和水稻秸秆单独降解的降解液和共降解的降解液中都为相对丰度最大的古菌。这是由于Methanosarcina能够利用多种底物来生成甲烷，而且对厌氧环境具有很好的耐受性[21]。此外，共降解液中还检测到氨氧化古菌。氨氧化古菌在氮循环过程中起着重要的作用[22]，而良好的氮循环有利于微生物生长[23]。因此，褐煤与水稻秸秆共降解可以维持厌氧产甲烷环境，保证其中的微生物活性，有利于其作用产甲烷。
图3 褐煤与水稻秸秆共降解和单独降解后降解液中古菌的群落组成Fig.3 Archaeal community structure of degradation solution after co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw
2.3 有机物分析结果
褐煤与水稻秸杆共降解、褐煤单独降解、水稻秸杆单独降解后降解液中有机物组成情况如图4所示。由图4可知，降解液中有机物主要分为酸类、醇类、酯类、酚类、酮类、烃类及其他，酸类、醇类和酯类的相对丰度在73.57%以上。在褐煤和水稻秸杆共降解液中，酸类是最为丰富的有机物，相对丰度为44.86%。而在褐煤单独降解和秸秆单独降解的降解液中酸类的相对丰度分别为8.02%和31.12%。可以看出，共降解液中有机酸含量最多。这与共降解中Clostridium和Paraclostridium等纤维素降解菌相对丰度的增大有关。秸秆中更多纤维素被降解产生有机酸。已有研究表明，有机酸是厌氧降解产甲烷的底物，可以被产甲烷菌降解生成甲烷[24-25]。此外，有机酸会对煤结构造成一定影响。乙酸会影响煤中官能团且乙酸相对丰度不同对煤中官能团的影响不同[26-27]。经过有机酸预处理后的煤孔隙结构发生变化[28-30]。因此，褐煤与水稻秸秆共降解中，更多的有机酸不仅增加了产甲烷底物，而且有机酸作用于煤结构，使煤更易于微生物利用，促进了甲烷增产。
图4 褐煤与水稻秸秆共降解和单独降解后降解液中有机物组成Fig.4 Composition of organic matter of degradation solution after co-degradation and separate degradation of lignite and rice straw
2.4 XRD分析结果
褐煤与水稻秸杆共降解和水稻秸杆单独降解前后水稻秸秆的XRD谱如图5所示。由图5可知，降解后水稻秸秆与原秸秆的XRD谱均在2θ为16°和22°出现了典型的纤维素Ⅰ型的特征峰[31]，说明其晶型结构相同，降解没有影响秸秆的纤维素类型。
图5 褐煤与水稻秸杆共降解和水稻秸杆单独降解前后水稻秸秆的XRD谱Fig.5 XRD spectra of rice straw before and after co-degradation of lignite and rice straw and separate degradation of rice straw
纤维素具有结晶区(定形区)和非结晶区(无定形区)两种，纤维素结晶度是指结晶区占纤维素整体的百分率，是纤维素材料被水解的关键影响因素[32]。通过公式(1)计算的CrI值揭示了水稻秸秆中纤维素结晶度的变化。原秸秆的CrI值为37.63%，单独降解后和共降解后秸秆的CrI值分别为36.03%和35.50%。秸秆单独降解和共降解产甲烷后，其CrI值较原秸秆的CrI值分别下降1.6%和2.13%，纤维素结晶区均受到影响。共降解结束后水稻秸杆的CrI值下降更多，说明共降解过程中水稻秸秆中结晶区纤维素受作用程度加深，这与共降解液中纤维素降解菌相对丰度增大有关。因此，褐煤与水稻秸秆共降解影响秸秆结构，共降解使秸秆中纤维素结晶度下降更多，秸秆更容易被水解用于产生甲烷。
2.5 13C-NMR分析结果
褐煤与水稻秸杆共降解和褐煤单独降解前后褐煤的碳骨架结构参数如表2所示。由表2可知，芳碳在褐煤中占据绝对优势，原褐煤的芳碳率为62.85%，单独降解后褐煤的芳碳率为62.25%，共降解后褐煤的芳碳率为61.37%。
相关研究表明，煤中大分子聚合物结构是芳香碳结构单元之间通过脂肪族和醚键连接形成[33]。芳香类化合物是煤分子的主要组成成分。与原褐煤相比，单独降解后褐煤与共降解后褐煤的芳碳率分别下降0.6%和1.48%，共降解后褐煤的芳碳率下降更多。在产甲烷的过程中，微生物能利用煤中的芳香族化合物产生甲烷。共降解中有机酸的积累会影响褐煤结构，易于微生物与煤接触，促进煤的降解[34]。因此，褐煤与水稻秸秆共降解促进了煤中的芳碳降解，提高了煤的降解程度，增大了甲烷产量。
表2 褐煤的碳骨架结构参数(%)Table 2 Carbon framework parameters of lignite(%)
1) 褐煤与水稻秸秆共降解可以提高生物甲烷产量，最大甲烷产量可达到388.47 μmol，比褐煤单独降解和秸秆单独降解的甲烷产量之和增长了116.53%。
2) 褐煤与水稻秸秆共降解使降解液中细菌群落结构发生变化，Clostridium和Paraclostridium等纤维素降解菌的相对丰度明显变大，同时，共降解促进秸秆中纤维素和煤中纤维素类衍生物的降解，增大甲烷产量。
3) 褐煤与水稻秸秆共降解体系中有机酸含量大幅提高，一方面可以提供充足的产甲烷底物，另一方面对煤中官能团和孔隙结构产生影响，有利于甲烷产生。
4) 相较于两者单独降解，褐煤与水稻秸秆共降解体系中菌群结构得到改善，提高了降解过程中有机酸含量，影响煤与秸秆的结构，共降解体系中水稻秸秆的CrI值和褐煤的芳碳率下降更多，使二者更容易被微生物利用，促进秸秆中纤维素和煤中芳香化合物降解，达到生物甲烷增产的效果。
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