张德胜, 乔 奇, 白瑞英, 田雨婷, 王 爽, 王永江, 赵付枚, 张振臣
(河南省农业科学院 植物保护研究所，河南省农作物病虫害防治重点实验室，农业农村部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室，郑州 450002)
甘薯黑斑病由甘薯长喙壳菌Ceratocystis fimbriataEllis et Halsted 侵染引起，在甘薯苗期、大田生长期和薯块储藏阶段均可发生，每年由该病造成的产量损失约为5%～10%，并严重影响薯块品质，是甘薯的主要病害之一[1]。近年来，甘薯鲜食和深加工产业随着其抗癌、降脂等营养保健价值被大众认同而发展迅速[2]，人们对薯块品质的要求进一步提高，对黑斑病的防治也愈加重视。施用杀菌剂是防治甘薯黑斑病的重要手段，而我国现阶段登记用于甘薯黑斑病的防治药剂仅有甲基硫菌灵、代森铵、乙蒜素、大蒜素和多菌灵5 种[3]，而多菌灵对甘薯黑斑病菌抑菌效果下降[4]，且与甲基硫菌灵有交互抗性[5-6]。尽管三唑类杀菌剂三唑酮、粉唑醇、苯醚甲环唑和戊唑醇[7-10]，无内吸作用的氟啶胺和百菌清[9,11]，以及苯并咪唑类杀菌剂噻菌灵等先后被尝试用于对甘薯黑斑病的防治[9,12]，但因残留、用药方式及防治效果、以及缺乏充分试验等原因，仍未解决生产中防治甘薯黑斑病的药剂匮乏问题。为了促进合理轮换用药、延缓抗药性产生、减少黑斑病导致的甘薯产量损失和品质下降，迫切需要筛选出安全高效的新类型杀菌剂。
咯菌腈属苯基吡咯类杀菌剂，在渗透信号转导中可抑制促蛋白激酶，具有非内吸性、广谱的特点[13]。此前先正达公司向欧盟提出，将甘薯中咯菌腈的最大残留限量 (MRL) 值从0.05 mg/kg 提高到10 mg/kg，期望将该药剂应用于甘薯生产，2010 年已获批准[14]。有试验表明，含咯菌腈的混剂可显著降低人工接种的甘薯薯块黑斑病的发病率[9]。此外，咯菌腈对影响薯块品质的黑痣病有明显的防治效果[15]，对控制甘薯储藏期腐烂有较好的效果[16]。同时，以咯菌腈为主要成分的杀菌剂防治甘薯储藏期病害的专利在我国已获得授权[17]。
咯菌腈已被用于多种重要植物病害的防治[13]，本研究观察了咯菌腈对甘薯长喙壳菌孢子萌发和芽管生长的影响，建立了甘薯长喙壳菌对咯菌腈的敏感基线，同时进行了50% 咯菌腈WP 对甘薯苗期和储藏期黑斑病的防治效果试验，期望为咯菌腈合理应用于甘薯黑斑病的防治提供依据。
1.1 供试材料
1.1.1 供试菌株 收集四川、河北、山东，以及河南洛阳、郑州、新乡和南阳地区的病薯，经表面消毒，取病健交接处薯肉置于马铃薯胡萝卜琼脂培养基 (PCA) 中，于25 ℃培养。菌株纯化后，回接验证得到64 株甘薯长喙壳菌[18]，于胡萝卜琼脂培养基 (CA) 上4 ℃保存。
1.1.2 供试甘薯 品种为商薯19，脱毒种薯由河南省农业科学院植物保护研究所提供。
1.1.3 供试药剂 98%咯菌腈原药 (fludioxonil 98% TC)，陕西恒润化学工业有限公司生产；
50%咯菌腈可湿性粉剂 (fludioxonil 50% WP)，瑞士先正达作物保护有限公司生产；
500 g/L 甲基硫菌灵悬浮剂 (thiophanate-methyl 500 g/L SC)，江苏蓝丰生物化工股份有限公司生产。咯菌腈原药溶于丙酮，用含0.1%吐温-80 的蒸馏水配制成1 mg/mL的母液备用。
1.2 仪器设备
JJ-CJ-2 洁净工作台，苏州市金净净化设备科技有限公司；
FYL-YS-280L 恒温箱，北京福意电器有限公司；
MLS-3 750 高压灭菌锅，日本三洋电机株式会社；
Axio Scope.A1 型正置显微镜，德国Carl Zeiss 公司。
1.3 试验方法
1.3.1 咯菌腈对甘薯长喙壳菌分生孢子萌发及芽管生长的影响 参照凹玻片法[19]，使用菌株CFSC-01 (CGMCC No. 3.18030)，培养10 d 后，用无菌去离子水洗下分生孢子，过滤后得到孢子悬浮液，调节浓度至2 × 105孢子/mL (并进行促萌发处理[20])。用无菌去离子水将咯菌腈母液稀释成系列浓度的溶液，与孢子悬浮液等量混合后，得到咯菌腈浓度为0.3、0.5、1 和2 μg/mL 的含孢子溶液。使用移液器将上述溶液滴在凹玻片上，25 ℃黑暗保湿培养3、5、7、9 和20 h，进行镜检和照相。
1.3.2 甘薯长喙壳菌对咯菌腈的敏感基线建立
分别采用凹玻片法[19]和平皿法[21]测定64 株甘薯黑斑病菌对咯菌腈的敏感性。测定其对分生孢子萌发的抑制活性时，参照1.3.1 节的方法。配制含咯菌腈的孢子悬浮液，咯菌腈的质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、1、2 和3 μg/mL，以含等量溶剂和吐温-80 的孢子悬浮液为空白对照。当空白对照孢子萌发率达到90% 以上时，采用血球计数板拍照计数法统计各处理孢子萌发情况，计算萌发抑制率。测定咯菌腈对菌丝生长的抑制活性时，配制含咯菌腈的PCA 平板，药剂质量浓度和空白对照的设置同前，采用十字交叉法测量菌落直径，计算各处理菌丝生长抑制率。计算药剂对各菌株的抑制中浓度 (EC50) 并比较两组EC50值间的差异。
1.3.3 咯菌腈浸苗对苗期黑斑病的防治效果 选择用人工接种病薯育苗的苗床为病圃，试验前清除所有病薯。以50% 咯菌腈WP 为供试药剂，以500 g/L 甲基硫菌灵SC 为对照药剂。共4 个处理：咯菌腈药液按有效成分250 和500 mg/L分别浸苗3 h；
对照药剂甲基硫菌灵药液按有效成分500 mg/L 浸苗6 h；
设不浸苗的空白对照处理。每处理3 次重复，每重复扦插100 株健康薯苗，小区随机区组排列。浸苗参照张德胜等方法[11]，于定植24 d 后随机拔取50 株调查发病情况及50 株的总鲜重。
1.3.4 咯菌腈对甘薯储藏期黑斑病的防治效果 (按薯块整体分级计算) 当年6 月份将患有黑斑病的薯块打碎后均匀撒入大田接种，整地起垄后移栽薯苗，生产的薯块用于储藏期试验。收获后，选取大小均匀、外观光滑无损伤的薯块装框，每框为1 个重复，大约100 块薯块。试验设4 个处理，分别为用50% 咯菌腈WP 有效成分250 和500 mg/L 药液、500 g/L 甲基硫菌灵SC 有效成分500 mg/L 药液和清水浸薯块对照处理，每处理3 次重复。将整框薯块浸入药剂溶液10 min，期间将框在药液中上下拉动3～5 次。处理结束后将框抬出控水晾干，入窖储藏35 d，调查薯块发病情况。试验分别于2019 和2020 年进行。
1.3.5 咯菌腈在薯块储藏期的残留量测定 选取表皮光滑且无损伤的薯块，装框后使用咯菌腈药液浸薯块 (方法同1.3.4 节)。咯菌腈药液有效成分质量浓度分别为250、500 和750 mg/L，不设重复。分别于储藏60 和90 d 时，每个浓度处理随机取2 kg 薯块，送至农业农村部产品及转基因产品质量安全监督检验测试中心 (杭州) 进行残留检测，残留标准查阅GB 2763—2021[22]。
应用DPS 8.01 专业版软件计算药剂对甘薯长喙壳菌菌丝生长、孢子萌发的毒力回归方程、EC50，进行两组数据的方差齐性及显著性检验，多重比较采用新复极差法进行[23]。
2.1 咯菌腈对甘薯长喙壳菌分生孢子萌发及芽管生长的影响
通过显微镜定时观察发现，清水对照处理中分生孢子萌发早，萌发率高，培养9 h 萌发率接近100%，芽管长度数倍于孢子本身长度。咯菌腈0.5 μg/mL 的处理培养9 h，约31% 的分生孢子未萌发，萌发的孢子芽管较少长于孢子本身长度。咯菌腈1 μg/mL 的处理培养9 h，仅有部分分生孢子处在萌芽状态，且芽管只表现为小的突起。咯菌腈2 μg/mL 的处理直至培养20 h，分生孢子完全不萌发 (图1)。结果表明，咯菌腈对甘薯长喙壳菌分生孢子的萌发有显著抑制作用，且随药剂质量浓度的加大而越加明显。
图1 咯菌腈对甘薯长喙壳菌分生孢子萌发的影响Fig.1 Effects of fludioxonil on conidial germination of C. fimbriata
培养9 h 后，清水对照处理中萌发的芽管基本呈直线生长，弯曲少，无分枝。咯菌腈0.3 μg/mL的处理中，部分孢子萌发的芽管有分枝，弯曲幅度加大。咯菌腈0.5 μg/mL 的处理中，部分孢子萌发的芽管有分支，出现了扭曲生长的现象 (图2)，说明咯菌腈对甘薯长喙壳菌分生孢子芽管生长有显著影响，主要表现为过早出现分支，生长扭曲，不能直线伸长。
图2 咯菌腈对甘薯长喙壳菌菌丝生长的影响Fig.2 Effects of fludioxonil on mycelium growth of C. fimbriata
2.2 甘薯长喙壳菌对咯菌腈的敏感基线
利用凹玻片法测定了64 株甘薯长喙壳菌分生孢子萌发对咯菌腈的敏感性，其EC50的分布范围为0.20～0.99 μg/mL，平均值为 (0.52 ± 0.16) μg/mL，敏感性频率分布呈单峰曲线，正态性检验 (Shapiro-Wilk 法)P= 0.33 ＞ 0.05，符合正态分布 (图3)，可以作为甘薯长喙壳菌分生孢子萌发对咯菌腈的敏感基线。
利用平皿法测定了64 株甘薯长喙壳菌菌丝生长对咯菌腈的敏感性，其EC50的分布范围为0.17～0.31 μg/mL，平均值为 (0.24 ± 0.03) μg/mL，敏感性频率分布呈单峰曲线，正态性检验 (Shapiro-Wilk法)P= 0.32 ＞ 0.05，符合正态分布 (图3)，可以作为甘薯长喙壳菌菌丝生长对咯菌腈的敏感基线。
图3 甘薯长喙壳菌孢子萌发 (A) 和菌丝生长 (B) 对咯菌腈的敏感性频率分布Fig.3 Frequency distribution of sensitivity on conidial germination (A) and mycelium growth (B) of C. fimbriata to fludioxonil
两种方法对相同菌株测定得到的两组EC50值均呈正态分布，经方差齐性检验 (P＜0.05，非齐性)，数据转换后采用t检验法比较两组EC50值，P＜0.01，表明两组数据差异极显著。咯菌腈对菌丝生长的抑制作用显著强于对分生孢子萌发的抑制作用。
2.3 咯菌腈对苗期黑斑病的防治效果
由表1 可知，50% 咯菌腈WP 500 mg/L 对苗期黑斑病的防治效果为90.24%，显著高于对照药剂500 g/L 甲基硫菌灵SC 的防治效果。50% 咯菌腈WP 250 mg/L 的防治效果为82.93%，略高于对照药剂，但无显著差异。50% 咯菌腈WP 250、500 mg/L 和清水对照处理的50 株薯苗总鲜重分别为2.05、2.08 和1.96 kg，3 处理间无显著差异，但显著低于对照药剂处理 (总鲜重2.27 kg)。
表1 咯菌腈对苗期黑斑病的防治效果Table 1 The control efficacy of fludioxonil to black rot of sweet potato seedlings
2.4 咯菌腈对储藏期黑斑病的防治效果
由表2 可知，2019 年50% 咯菌腈WP 500 mg/L对储藏期黑斑病的防治效果为84.41%，显著高于对照药剂500 g/L 甲基硫菌灵SC。50% 咯菌腈WP 250 mg/L 的防治效果为63.43%。2020 年50%咯菌腈WP 250 和500 mg/L 对储藏期黑斑病的防治效果分别为68.03%和82.30%，均显著高于对照药剂。
表2 咯菌腈对储藏期黑斑病的防治效果Table 2 The control efficacy of fludioxonil to black rot of sweet potato in storage
2.5 储藏期甘薯块中咯菌腈的残留量
检测结果 (表3) 表明，储藏60 d 后50% 咯菌腈WP 250～750 mg/L 处理在甘薯块中的残留量为1.11～2.39 mg/kg，储藏90 d 后为0.54～1.68 mg/kg，符合我国甘薯农药残留限量标准[22]。
表3 施用50% 咯菌腈WP 后甘薯块中的残留量及相关标准Table 3 Residual quantity of fludioxonil 50% WP in root tuber of sweet potato and standard of MRL and ADI
本研究观察了甘薯长喙壳菌分生孢子在不同浓度的咯菌腈药液中萌发及芽管伸长的情况。与空白对照处理相比，咯菌腈处理使甘薯长喙壳菌分生孢子萌发受到抑制，部分萌发的芽管过早出现分支，并且出现了扭曲生长的现象，且当咯菌腈的质量浓度增加时，芽管的扭曲程度随之增加。芽管过早出现分支的现象与徐建强等报道的咯菌腈可引起牡丹叶片黑斑、黄斑病菌芽管在萌发时就开始产生分支的结果类似[24]，咯菌腈引起甘薯长喙壳菌芽管的扭曲生长与咯菌腈对黄瓜靶斑病菌菌丝生长的影响类似[25]，但并未见咯菌腈引起油菜核盘菌和小麦赤霉病菌菌丝末端分支增多的现象[26-27]。不同病原菌芽管生长受咯菌腈抑制的表现存在差异。敏感性检测结果表明，咯菌腈对甘薯长喙壳菌的分生孢子萌发和菌丝生长均有明显的抑制作用，且对菌丝生长的抑制作用强于对分生孢子萌发的抑制作用，这与文献报道结果一致[24,28]。
土壤带菌情况下，用50% 咯菌腈WP 不同浓度药液浸苗，对苗期甘薯黑斑病的防治效果显著高于同浓度的500 g/L 甲基硫菌灵SC，即使剂量减半也表现出良好的防治效果；
咯菌腈WP 对储藏期甘薯黑斑病的防治效果亦显著高于同浓度的甲基硫菌灵，且两年试验的防效结果稳定。用咯菌腈WP 250～750 mg/L 处理薯块，在储藏60 和90 d 的残留量均低于我国规定的MRL 值。以上结果表明，使用咯菌腈防治甘薯黑斑病颇具可行性。鉴于黑斑病在甘薯的整个生育期及储藏期均能发生且侵染途径复杂，还需针对甘薯不同生长阶段黑斑病的发病特点，进一步开展咯菌腈防治试验。探索将咯菌腈与其他杀菌剂进行复配，筛选增效组合，促进咯菌腈应用于甘薯生产。
浸苗试验中，清水对照处理和甲基硫菌灵处理定植24 d 病株率分别为27.33%和6.00%，对应的折合株鲜重分别为39.2 和45.4 g；
已报道的相同浸苗方法试验中，空白对照处理和甲基硫菌灵处理定植21 d 病株率分别为81.3%和13.3%，对应的株鲜重为25.0 和60.1 g[11]，发病率高时，株鲜重降低更明显，表明黑斑病对薯苗生长有明显的抑制作用，发病率会影响薯苗平均鲜重的变化。本次浸苗试验整体发病较轻，各处理间鲜重变化较小，以及不同扦插茎段生长势的差别，可能是试验中咯菌腈虽然防治效果最显著但薯苗鲜重却未表现最高的原因。后续试验中将进一步研究咯菌腈对甘薯植株长势和产量的影响。
随着咯菌腈在多种作物上的长期使用，现已发现国内黄瓜、番茄和草莓上产生了灰霉病菌的抗性菌株[29-30]，国际上在2010 年以前已有咯菌腈抗性菌株出现的报道[31]。推广防治甘薯黑斑病前，建立该病原菌对咯菌腈的敏感基线，对明确该菌的敏感性水平，检测、监测抗药性有重要意义。本次试验分离的菌株来自多省，测定咯菌腈抑制分生孢子萌发时，EC50值最大相差4.95 倍；
抑制菌丝生长时，EC50值最大相差1.74 倍，菌株间差异水平低，建立的敏感基线可靠性较高，有实际的参考价值。鉴于部分甘薯产区的菌株未采集到，后续研究中将进一步补充，完善敏感基线。
总之，咯菌腈对甘薯长喙壳菌的孢子萌发、菌丝生长均有较高的毒力，防治甘薯苗期和储藏期黑斑病均有较好的防治效果，薯块储藏60 和90 d的残留量符合MRL 标准，具有在甘薯生长期和储藏期防控黑斑病的潜力，有较好的应用前景。
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